丙戊酸增加乳腺癌细胞对硫酸羟脲敏感性及其分子机制的研究

摘要

目的：
　　本课题将探讨VPA是否可以增加乳腺癌细胞EUFA423对HU的敏感性，以及VPA增加乳腺癌细胞对HU的敏感性是否与REPA2-p介导的HR修复通路有关，从而为VPA和HU联合应用于临床治疗乳腺癌提供重要的理论及实验依据。
　　方法：
　　1.表达同源重组底物pDR-GFP的细胞系工作模型的建立
　　通过Lipofectamine2000和Opti-MEM，将含有pDR-GFP的质粒转入EUFA423细胞，并通过含有嘌呤霉素(Puromycin，puro)的DMEM培养基筛选出稳定表达pDR-GFP质粒的EUFA423细胞(EUFA423/pDR-GFP)。通过流式细胞仪检测能发出绿色荧光蛋白的细胞，进一步筛选出能稳定表达同源重组底物pDR-GFP的EUFA423细胞。
　　2.大鼠原发性乳腺癌原代培养的细胞的获取
　　用二甲基苯并[a]蒽(Dimethyl-benzanthracene，DMBA)对50日龄的雌性SD大鼠进行染毒，约90天后，大鼠被诱导出原发性乳腺癌。在无菌环境中取出大鼠的原发性乳腺癌组织，一部分乳腺癌组织剪碎后用于原代细胞培养，另一部用于病理形态学鉴定。
　　3.细胞分组及各组药物处理条件
　　实验选用乳腺癌细胞系EUFA423，主要分为四个处理组，分别是:空白对照组、VPA单独作用组、HU单独作用组、VPA和HU联合作用组。其中，VPA单独作用组又分为0.5mM的VPA作用EUFA423细胞24h和48h两组;HU单独作用组是指用2mM的HU作用EUFA423细胞18h;VPA和HU联合作用组又分为先用0.5mM的VPA作用EUFA423细胞24h和48h，之后再用0.5mM的VPA与2mM的HU共同作用EUFA423细胞18h两组。
　　4.药物处理后所致的DNA DSBs的检测
　　各组细胞药物处理后，取生长状态良好，处于对数生长期的EUFA423细胞，制成细胞悬液，分别进行中性彗星实验和碱性彗星实验。用尼康ELIPSE Ti-U倒置荧光显微镜观察各组细胞拖尾并拍照，用cometscore对各组细胞拖尾尾距进行定量分析。
　　各组细胞药物处理后，收取各组细胞蛋白，通过免疫印迹和免疫荧光实验，检测各组细胞中γH2AX蛋白及其焦点的表达。
　　通过上述的细胞拖尾尾距、γH2AX蛋白及其焦点表达情况，反映各组细胞DNA DSBs的差异。
　　5.细胞克隆形成实验检测药物作用所致的DNA DSBs对乳腺癌细胞存活的影响
　　取生长状态良好，处于对数生长期的EUFA423细胞接种于60mm培养皿中，每组设置三个平行样。药物处理后继续静置培养14天，直至培养皿底出现肉眼可见的细胞克隆，终止培养。阳性细胞克隆为含有≥50个细胞。结晶紫染色细，胞克隆后，进行克隆计数，计算各组的细胞克隆形成率。
　　结果：
　　1.安全剂量的VPA可致乳腺癌细胞核内由HU所致的DNADSBs进一步蓄积
　　中性彗星实验和碱性彗星实验均显示，与对照组比，单独VPA作用组的细胞尾距有轻度增加，单独HU作用组的细胞尾距则明显增加，VPA和HU联合作用组细胞尾距增加最为明显(P＜0.05)。
　　免疫印迹结果显示，在没有HU处理的情况下，EUFA423细胞中无DNADSBs蓄积;单独HU处理后，EUFA423细胞中γH2AX蛋白表达明显升高;VPA预处理24h和HU联合作用组与HU单独作用组相比，γH2AX蛋白表达升高并不明显，但VPA预处理时间延长至48h时，联合作用组与HU单独作用组相比，γH2AX蛋白表达升高了1.4倍(P＜0.05)。
　　免疫荧光结果显示，单独VPA作用组与对照组相比，只有少量EUFA423细胞中出现γH2AX焦点;单独HU作用组与对照组相比，含有γH2AX焦点细胞的百分率增加了3.0倍(P＜0.05);VPA预处理24h和48h后与HU联合作用组同对照组相比，含有γH2AX焦点细胞的百分率分别增加了4.5倍和4.8倍(P＜0.05)。
　　2.安全剂量的VPA可增加乳腺癌细胞对HU的敏感性
　　细胞克隆形成实验结果显示，与对照组相比，单独VPA作用24h和48h，细胞存活率分别下降19.55％和35％(P＜0.05);单独HU作用时，细胞存活率下降52.63％(P＜0.05);VPA预处理24h和48h后与HU联合作用，细胞存活率分别下降70.62％和81.04％(P＜0.05)。由于VPA也使细胞存活率出现明显降低，为排除VPA和HU联合作用组细胞存活率的明显降低可能是两药作用的叠加而非协同，我们对实验结果进行标化。标化后结果显示，两药联合作用组相较于单独HU作用组仍表现出细胞存活率的明显降低(P＜0.05)，说明VPA与HU的联合使得EUFA423细胞存活率降低是协同作用，即安全剂量VPA可增加EUFA423细胞对HU的敏感性。
　　3.成功建立细胞系工作模型
　　流式细胞术结果显示通过含有puro的DMEM培养基，成功筛选出表达同源重组底物pDR-GFP的EUFA423细胞，建立EUFA423/pDR-GFP细胞系。
　　4.安全剂量的VPA可抑制乳腺癌细胞对HU所致复制叉阻滞的修复功能
　　免疫印迹实验检测损伤细胞恢复24h后的细胞中γH2AX蛋白的含量，单独VPA作用所致的微量的γH2AX蛋白含量在恢复24h后已不能检测，说明此时细胞内DNA DSBs已完全被修复;恢复24h的单独HU作用组的γH2AX蛋白表达量也明显降低(P＜0.05);但VPA和HU联合作用组γH2AX蛋白表达量依然很高(P＜0.05)，显示两药联合作用组细胞对DNA DSBs修复能力明显减弱。
　　通过免疫荧光实验检测恢复24h后含γH2AX焦点细胞的百分率，单独HU作用组与对照组相比，含有γH2AX焦点细胞的百分率增加了2.1倍(P＜0.05)，与未恢复时的3.0倍相比明显降低;VPA预处理24h和48h与HU联合作用组与对照组相比，含γH2AX焦点细胞的百分率分别增加了4.3倍和4.9倍(P＜0.05)，与未恢复24h时的4.5倍和4.8倍相比并无明显差异。
　　5.安全剂量的VPA可抑制乳腺癌细胞对HU所致复制叉阻滞的HR修复功能，且与细胞周期无关
　　流式细胞术检测各处理组EUFA423/pDR-GFP细胞HR修复效率。对照组EUFA423/pDR-GFP细胞HR修复效率为74.2*10-6;单独VPA作用组EUFA423/pDR-GFP细胞的HR修复效率降低至61.3*10-6，降低了17.39％(P＜0.05);单独HU作用组EUFA423/pDR-GFP细胞的HR修复效率显著升高至141.9*10-6，升高了91.24％(P＜0.05);而当VPA和HU联合作用时，与单独HU作用组相比，EUFA423/pDR-GFP细胞的HR效率明显降低至100*10-6，降低了29.52％(P＜0.05)。
　　通过流式细胞术检测BrdU掺入反映的细胞周期的结果显示，与对照组相比，单独HU作用组和两药联合作用组S期的EUFA423细胞明显增多，但两药联合作用组与单独HU作用组相比，EUFA423细胞在S期的蓄积并无明显差异。结合之前的实验结果，即使VPA和HU联合作用表现出EUFA423细胞在S期的蓄积，但与HU单独作用组相比，VPA和HU联合作用仍可以明显的降低EUFA243细胞的HR修复能力，说明VPA抑制EUFA423细胞对HU所致复制叉阻滞的HR修复功能与细胞周期无关。
　　结论：
　　1.安全剂量VPA可进一步造成HU所致的DNA DSBs在乳腺癌细胞EUFA423内的蓄积，并增加乳腺癌细胞对HU的敏感性;
　　2.安全剂量VPA与HU联合作用，通过抑制REPA2-p-Rad51介导的HR修复通路，从而抑制乳腺癌细胞的生长;
　　3.安全剂量VPA增加乳腺癌细胞对HU的敏感性与细胞周期无关;
　　4.在DMBA诱导的大鼠乳腺癌原代培养的细胞中，安全剂量VPA与HU联合作用导致细胞核内DNA DSBs蓄积，且细胞修复DNA DSBs能力减弱，降低细胞存活。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

1．HU作为化疗药物的抑癌机制

2．VPA抑癌机制及其放射增敏作用

3．HR修复及其关键蛋白

细胞株

主要仪器

主要耗材

实验步骤和主要试剂

统计学分析

实验结果

一、安全剂量的VPA可导致乳腺癌细胞核内由HU所致的DNA双链断裂进一步蓄积

二、安全剂量的VPA可增加乳腺癌细胞对HU的敏感性

三、安全剂量的VPA可抑制乳腺癌细胞对HU所致复制叉阻滞的修复功能

四、安全剂量VPA抑制乳腺癌细胞对HU所致复制叉阻滞的HR修复功能，且与细胞周期无关

五、安全剂量VPA通过抑制REPA2-p-Rad51介导的HR修复通路增加乳腺癌细胞对HU的敏感性

六、安全剂量VPA与HU联合作用对DMBA诱导的大鼠原发性乳腺癌原代培养细胞的影响

讨论

结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文

学位论文评阅及答辩情况表