脂肪干细胞结合大鼠肾脏脱细胞支架进行肾脏再生的研究

摘要

终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)是指各种慢性肾脏疾病的终末阶段，以肾功能完全和永久性丧失为特点，已经成为全球死亡率较高的疾病之一。ESRD目前没有有效的治疗方法，主要通过透析维持或进行肾脏移植治疗。透析治疗仅可部分替代肾脏的滤过功能，且长期透析可导致电解质失衡、心血管疾病等并发症，同时会给患者及家属造成严重经济负担。肾脏移植是目前最有效的治疗方法，但是由于供体肾脏严重短缺，大部分病人只能靠血液透析和腹膜透析来维持生命，等待肾源。即便是肾移植术后患者，也需要长期服用抗免疫排斥药物。目前患者数量正在逐年增加，加之ESRD患者的基数庞大，而可供移植的供体肾脏数目并没有明显增加，目前供肾短缺的困境正在日益加剧。为了缓解这一矛盾，学者们试图通过细胞-支架技术再生部分肾脏，以期能够部分或者完全替代正常肾脏功能。
　　该技术另一重要部分是需要合适的种子细胞。学者们尝试过胚胎干细胞(embryo stem cells，ESCs)、新生大鼠肾脏细胞、胎肾细胞、脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)等，也取得了较好的试验结果。但如若应用到临床，这些细胞都无法推广，或者是因为细胞本身就存在严重伦理问题，或者有成瘤倾向及细胞调控等问题。而脂肪干细胞(adipose tissue-derivedstem cells，ADSCs)作为近年来新兴的多能干细胞，其用于骨组织、脂肪组织、肌组织及神经组织的再生能力得到了肯定。有研究显示，ADSCs作为中胚层来源的干细胞，能够分化成中胚层来源的各种细胞，相关研究也已证实了ADSCs可以分化为骨细胞、脂肪细胞、肾小管细胞、肌细胞、神经细胞等成体细胞。
　　本研究拟用ADSCs作为种子细胞，并选取合适的大鼠肾脏脱细胞支架进行肾脏再生的研究，对ADSCs在支架内的生长情况及在肾系分化中的潜力进行评估。
　　本文主要从以下几方面进行论述：
　　第一部分 大鼠肾脏脱细胞支架的准备及检测
　　目的：
　　对两种常用大鼠肾脏脱细胞获得支架进行评估，选择合适的支架进行下一步肾脏再生研究。
　　方法：
　　(1)大鼠肾脏的获取
　　选择250g左右雄性Wistar大鼠，麻醉良好，PBS充分灌洗后完整取出双侧肾脏、肾动静脉及肾输尿管，肾动脉及输尿管内置管。
　　(2)制备肾脏脱细胞支架
　　整体组大鼠进行肾脏置管，切片组大鼠肾脏切为4片左右，平均厚度2～3mm。选择0.5％ SDS作为脱细胞液，记录两组内组织脱细胞至肉眼可见的白色半透明时所用的时间。PBS洗24h，再进行下一步研究。
　　(3)对比两种肾脏脱细胞支架
　　对比通过两种方式获得的肾脏脱细胞支架，通过形态观察、Movat五色套染、电镜扫描、免疫学检测及分子学检测进行评估，选取下一步试验所用的肾脏支架。对比内容包括:
　　1)从正常肾脏组织脱细胞至白色半透明状，脱细胞前后大体外观变化及所用时间。
　　2)HE染色进行形态学对比，观察两种切片脱细胞是否彻底，并且观察两组脱细胞支架组织形态与正常肾脏有无明显差异。
　　3)进行Movat五色套染，观察组织着色有无明显差异。着色差异表明成分含量的差异。
　　4)进行扫描电镜检测(scanning electron microscopy，SEM)，观察电镜下组织纤维条索外观、粗细及走形有无差异。
　　5)进行免疫组化及免疫荧光检测，观察两组脱细胞支架与正常肾脏相比，骨架蛋白如纤连蛋白、弹性蛋白及Ⅳ型胶原分布表达有无明显差异。
　　6)测量组织干重，并且进行DNA含量、总蛋白含量、sGAG含量、细胞外因子含量检测，比较两组支架的差异。
　　结果：
　　(1)两组肾脏组织脱细胞至同样的白色半透明状，所用时间有明显差异。整体组用时(6.6±0.27h)明显少于切片组(25.21±0.62h)，表明整体组脱细胞效率明显高于切片组。
　　(2)HE染色可见两种脱细胞支架细胞均脱得较为彻底，无明显细胞核结构存在，且两种脱细胞支架结构相似，均无明显结构破坏。Movat五色套染可见整体脱细胞支架偏黄，且整体支架血管部位着色较深，显示为黑色，表明整体支架中胶原及弹力纤维高于切片支架，SEM检测显示两种脱细胞支架纤维条索结构类似，纤维直径无明显差异。免疫荧光及免疫组化可见种结构蛋白分布情况类似。
　　(2)两组支架进行比较，整体组干重(0.023±0.005 g)明显高于切片组(0.016±0.002 g)，整体组DNA(2.07±0.11 ng/mg)含量略高于切片组(1.06±0.13 ng/mg)，蛋白含量整体组（0.228±0.01μg/mg）明显高于切片组(0.039±0.004μg/mg)、sGAG含量整体组(9.62±0.08μg/mg)高于切片组(1.19±0.02μg/mg)。细胞外因子含量检测整体组也明显高于切片组。
　　结论：
　　(1)整体灌注脱细胞与肾脏切片浸泡旋转脱细胞两种脱细胞方式使用0.5％SDS均可获得脱细胞较为彻底的肾脏支架，但获得的脱细胞支架不相同，两种脱细胞方式不能相互替代。
　　(2)整体组灌注脱细胞较切片组脱细胞所用时间更短，效率更高，可以保留脱细胞支架中更多的骨架成分如骨架蛋白、sGAG及细胞因子，应该更适合脱细胞支架再细胞化的研究。
　　第二部分 ADSCs的分离、支架再细胞化及相关鉴定
　　目的：
　　研究从组织中分离ADSCs的方法，并且对分离的ADSCs进行鉴定。使用培养的ADSCs作为种子细胞进行再生肾脏，培养不同天数后，观察ADSCs在支架内的生长情况，并进行鉴定。
　　方法：
　　(1)从大鼠腹股沟取脂肪垫，使用Ⅰ型胶原酶及改良的分离方法分离细胞，进行原代培养。培养5～7天后，细胞融合密度约为80％左右进行传代培养。
　　(2)传代培养后的细胞进行成骨、成脂分化鉴定及流式细胞鉴定。
　　(3) ADSCs经过传代后，大量培养扩增。用0.25％的胰酶对细胞进行消化、离心、重悬，调整细胞浓度为1～5×107。每次接种双侧肾脏，约需8～10ml细胞悬液。
　　(4)细胞种植
　　1)将细胞悬液以1ml/min的速度注射大鼠肾动脉中，每个大鼠肾脏血管系统内接种约2ml。然后连接输尿管通道与接口，接口外连接细胞悬液。封闭动脉连接通道及废液流出通道，平衡气体通道连接负压泵。打开负压泵，调节负压为-40cm H2O，控制细胞注入速度约为1 ml/min，集合系统接种约2ml细胞悬液。种植支架静置过夜，给细胞足够时间贴壁。次日肾脏恢复灌注。
　　2)同样的方法，将准备好的整体支架先使用浓度为0.25 ng/mL的基质细胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）溶液浸泡，再同样灌注细胞，静置过夜培养。
　　(5)再生肾脏培养
　　开始灌注之前，先将含有5％ CO2及95％空气的平衡气连接气流瓶，通过气流瓶之后连接无菌滤器进行滤过，保证气体无菌，再接入新鲜DMEM/F12培养基内。接入平衡气的培养基再进行灌注，调整转速为1转/min，保证再生肾脏在获得足够营养的同时也能获得足够的气体。使用过滤的CO2平衡气及培养基进行培养，37℃连续培养不同天数。
　　(6)再生肾脏鉴定
　　取不同培养天数的再灌注肾脏及添加SDF-1后的再生肾脏进行HE染色，观察细胞贴壁情况。对生长较好时间段的再生肾脏切片进行免疫组化及免疫荧光检测，观察细胞有无分化。
　　结果：
　　(1)使用改良方法获得ADSCs细胞形态和生长速度良好。成骨、成脂分化良好，流式细胞鉴定CD90、CD44阳性，CD45阴性，表明干细胞特性保持较好。
　　(2)再种植后，无SDF-1细胞因子组的细胞均匀贴附在肾小球、肾小管等结构内，形成类似肾小球、肾小管的结构，细胞贴壁数量在五天左右达到高峰，继续培养细胞数量逐渐减少。
　　(3)加入SDF-1因子并培养至第五天时细胞贴壁数量较多，但是大量细胞成团聚集，无法分辨形成的结构。
　　(4)无添加SDF-1及添加SDF-1因子组5天左右的再生肾脏进行免疫荧光及组化鉴定，发现贴壁细胞CD31、Vwf、水通道蛋白Ⅰ、α1钠-钾ATP酶均有阳性表达。
　　结论：
　　(1)本研究使用的ADSCs分离方法获得细胞状态良好，可用于下一步研究。
　　(2)不添加SDF-1因子组ADSCs细胞贴壁五天左右达到高峰。
　　(3)再生肾脏支架培养至第五天进行鉴定，贴壁细胞表达血管内皮、肾小管标记物，表明ADSCs向肾小球、肾小管方向分化，证明ADSCs有向肾系分化的潜力，可用做肾脏再生的种子细胞。
　　(4) SDF-1可促进细胞粘附贴壁，但大量细胞成团状聚集，结构无法辨识，其使用方法仍需要进一步研究。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 大鼠肾脏脱细胞支架的建立

引言

1．材料

2．方法

3．统计学分析

4．结果

5．讨论

6．结论

第二部分 ADSCs分离、支架再细胞化及相关鉴定

引言

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

5．结论

附表

附图

参考文献

综述 细胞-支架技术在肾脏再生中的研究进展

致谢

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