花生二酰甘油酰基转移酶(AhDGAT)基因家族的功能与调控研究

摘要

近年来，中国对植物油的需求越来越大，自给率严重不足，2016年中国大豆进口超过8，000万吨，在当前和今后一段时间内中国将持续面临食用油短缺的严峻局面。花生油是中国主要的食用油之一，花生油脂肪酸配比合理、烟点高，在中国食用油消费中占比越来越大。花生油需求的增加导致对花生含油量和油脂品质的关注增加。据统计，花生含油量提高1％，相当于产量提高2％，企业效益可提高7％以上。常规花生品种的含油量大约为50％，高油花生品种可达55％以上，可见在花生含油量上还有较大提升空间。长期以来，花生育种主要关注产量，在花生含油量和油脂品质育种方面没有较大突破。因此，研究花生油脂合成相关基因及其调控机制，有助于通过分子育种培育高油、优质的花生新品种，对于缓解中国目前食用油危机具有重要意义。
　　在油料作物中，油脂主要以三酰甘油(triacylgycerol，TAG)的形式贮存在种子中，二酰甘油酰基转移酶(Diacylgycerol Acyltransferase，DGAT)直接参与TAG合成。DGAT分为DGAT1、DGAT2、DGAT3和WSD/DGAT四个亚家族，其中DGAT1和DGAT2负责种子中大部分油脂的合成，是TAG合成的关键基因。DGAT1和DGAT2虽然都能合成TAG，但是它们具有不同的亚细胞定位和表达模式，没有功能冗余。目前对植物DGAT1和DGAT2的研究基本都是通过过量表达，来验证基因促进油脂合成增加的功能，而对于DGAT进化及其分子调控机制方面的研究鲜见报道。因此，本研究对花生中负责TAG合成的AhDGAT1和AhDGAT2进行系统研究，分析其遗传变异和进化，阐明其基因功能，揭示其分子调控机制，从而为高油花生育种和油脂品质改良奠定理论基础。
　　1.植物DGAT家族的遗传变异和进化研究
　　植物油脂合成过程复杂，涉及基因众多。为了解DGAT基因的遗传变异与进化，选取30个物种检索DGAT的同源序列，并对这些序列做了进化分析。结果如下:
　　(1)进化树分析。通过对30个物种中DGAT基因的检索分析，发现该家族基因在植物中广泛存在，是比较古老的基因。DGAT1、DGAT2和DGAT3的亲缘关系较近，而它们与WSD/DGAT的亲缘关系较远。DGAT家族的进化伴随着植物进化同步进行，DGAT亚家族分化早于植物进化。WSD/DGAT亚家族进化树中，第Ⅲ和Ⅳ分支比较特殊，它们只存在于高等双子叶植物。4个亚家族在进化中都发生基因加倍，这种只含有高等植物的分支可能是由谱系特异的基因加倍导致。
　　(2)植物DGAT家族基因结构、表达模式、蛋白跨膜区和保守结构域分析。从30个物种中选取具有代表性的18个物种，对其DGAT家族基因进行具体分析，发现4个DGAT亚家族的特点明显不同。A.基因结构不同:DGAT1外显子数目多为15-16个，DGAT2多为8-9个，DGAT3多为2个，WSD/DGAT多为5-7个。B.跨膜区数量不同:DGAT1含有8-9个跨膜区，DGAT2含有1-4个跨膜区，DGAT3不含有跨膜区，而WSD/DGAT具有0-1个跨膜区。C.保守结构域不同:每个亚家族有自己特有的保守结构域。D.表达模式不同:在拟南芥和大豆中，DGAT1、DGAT2和DGAT3的表达范围较广，在种子中表达量较高;WSD/DGAT表达范围相对较窄，在种子中表达量较低。玉米中4个DGAT亚家族在各个组织都表达。这些差异表明他们在植物起源之前就具有不同的祖先，并且具有不同的进化历史。
　　(3)植物DGAT家族可变剪接分析。可变剪接是真核生物中一种调控基因功能的重要方式。通过对18种植物DGAT基因的可变剪接分析，发现其可变剪接方式主要为内含子滞留、内含子3'-端可变剪接和5，-端可变剪接。DGAT1发生可变剪接的位置和类型相对保守，而DGAT2不保守。WSD/DGAT在棉花、大豆和拟南芥中可变剪接位置与在二穗短柄草中存在明显差异。
　　2.可变剪接调控花生DGAT1的功能研究
　　从丰花1号花生品种中克隆了7条AhDGAT1序列(AhDGAT1.1-1.7)，它们是AhDGAT1不同剪接体形式。这是首次在植物DGAT基因中发现存在可变剪接现象。为验证各个剪接异构体的功能及其调节作用，开展了四方面的研究:
　　(1)表达模式分析。AhDGAT1.1-1.7分为两个亚型，AhDGAT1.1-1.3之间相似性为98.4％,AhDGAT1.4-1.7之间相似性为97.2％，其中AhDGAT1.2和AhDGAT1.4编码区提前终止。用Taqman探针荧光定量方法分析AhDGAT1.1-1.7表达模式，结果显示7条AhDGAT1序列的表达模式基本相似，都是在果针入土15d和30d的种子中表达量最高。各组织中AhDGAT1.1表达量显著高于AhDGAT1.2和AhDGAT1.3。除种子外的组织中，AhDGAT1.1在根中表达量最高，AhDGAT1.2在花中表达量最高。AhDGAT1.4只在叶和果针入土15d的种子中表达，AhDGAT1.5-1.7在各个组织器官都表达。
　　(2)利用TAG合成缺陷型酵母菌株H1246验证各个剪接异构体的功能。7个AhDGAT1序列在酵母H1246中过表达，AhDGAT1.2和AhDGA T1.4由于编码提前终止，不能恢复H1246合成TAG的能力，AhDGAT1.1、AhDGAT1.3和AhDGAT1.5-1.7转基因酵母油脂和脂肪酸含量提高3-5倍，其中AhDGAT1.5含量最高。AhDGAT1.1和AhDGAT1.5-1.7转基因酵母中C16∶0、C16∶1、C18∶0和C18∶1含量显著升高。
　　(3)可变剪接对AhDGAT1功能的调节作用。为分析AhDGAT1.2和AhDGAT1.4是否参与AhDGAT1其它剪接异构体的调控，构建了5个双基因共表达载体:AhDGAT1.1+1.2、AhDGAT1.2+1.3AhDGA T1.4+1.5/1.6/1.7，转化H1246菌株验证功能。每个转双基因酵母都具有合成TAG的能力，但是其油脂含量和脂肪酸组分与转单基因酵母相比发生变化。油脂和脂肪酸总量方面，AhDGA T1.1+1.2转基因酵母油脂和脂肪酸含量低于AhDGA T1.1;AhDGAT1.2+1.3的含量高于AhDGAT1.3;AhDGAT1.4+1.5和AhDGAT1.4+1.6的含量低于AhDGAT1.5和AhDGAT1.6。脂肪酸组成方面，AhDGAT1.1+1.2转基因酵母的C16∶0含量比例由17.5％下降到7.6％，AhDGAT1.4+1.51拘C16∶1含量比例由26.7％下降到0.8％，其C18∶0含量比例由10.9％上升到22.9％，说明转双基因酵母的底物特异性发生变化。AhDGAT1.2和AhDGAT1.4虽然没有酰基转移酶功能，但是可以通过调节其它剪接异构体来发挥作用。
　　(4)利用转基因烟草验证AhDGAT1的功能。将AhDGAT1.1在烟草中过表达，转基因烟草种子脂肪酸含量上升16.1％-23.5％，但油亚比（油酸/亚油酸）下降。
　　3.AhDGAT2关键酶活性位点的挖掘
　　研究表明植物DGAT2与特殊脂肪酸积累有关，如蓖麻酸和棕榈酸等，但是目前对影响DGAT2功能和底物特异性的关键酶活性位点了解很少。本实验室从11个花生品种中克隆了9个AhDGAT2序列(AhDGAT2a-i)，发现不同序列之间存在9处氨基酸差异。为验证这些位点与酶活性之间的关联，设计9个位点的单点突变，验证其对酶活性的影响。结果如下:
　　(1)AhDGAT2氨基酸位点单点突变体功能验证。9条AhDGAT2氨基酸序列存在9处差异(D3V、N6D、A9V、A26P、T37M、T107M、S118P、K251R、L316P)。以AhDGAT2a为基准进行单点突变，将AhDGAT2a及其突变序列转化酵母H1246，并进行油脂和脂肪酸含量检测。结果表明，与AhDGAT2a转基因酵母相比，N6D和A26P转基因酵母油脂含量分别上升16.4％和17.1％，脂肪酸含量分别上升35.6％和26.8％;而L316P油脂和脂肪酸含量与空载对照基本一致，表明其不具备TAG合成能力。突变体转基因酵母脂肪酸组成也发生变化，D3V和T107M脂肪酸中C18∶0的含量比例下降24.8％和37.3％，N6D脂肪酸的C16∶1含量比例升高46.8％，A26P脂肪酸中C16∶0含量也上升显著。说明N6D和A26P突变导致AhDGAT2a酶活性升高，L316P突变导致酶活性消失，并且突变影响了AhDGAT2a的底物特异性。
　　(2)利用转基因烟草验证AhDGAT2a的功能。在烟草中过表达AhDGAT2a，转基因烟草种子脂肪酸含量升高21.1％-26.9％，油亚比上升，叶片脂肪酸含量也有升高。
　　含油量是数量性状，受多基因调控，各基因之间互相协调，共同决定油脂含量的高低。本论文系统研究了AhDGAT1和AhDGAT2的功能及其调控方式，获得一些新发现:1.可变剪接对AhDGAT1亚家族基因的功能具有一定的调节作用。AhDGAT1可以通过产生不同剪接异构体来调节自身功能;2.鉴定了AhDGAT2中几个关键酶活性位点，其中N6D和A26P两个位点的突变使酶活性上升，而L316P位点突变后酶活性消失。本论文从一个新的角度揭示了花生油脂合成与调控的复杂性，是对植物油脂合成调控机制研究的有益补充，为花生高油育种与品质改良提供一定的理论支撑。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 文献综述

1 植物DGAT研究进展

1．1 植物DGAT分类

1．2 DGAT亚细胞定位和表达模式

1．3 DGAT的生物学功能

1．4 DGAT的底物特异性

2 可变剪接研究进展

2．1 可变剪接的种类

2．2 RNA剪接的机制

2．3 可变剪接的调控

2．4 可变剪接的功能

3 立题依据

第二部分 实验部分

第一章 植物DGAT基因家族的遗传和进化分析

1．1 材料方法

1．2 结果与分析

1．3 讨论

第二章 可变剪接调控花生AhDGAT1的功能

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 结果与分析

2．4 讨论

第三章 花生AhDGAT2酶关键活性位点的探索

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 结果与分析

3．4 讨论

全文总结

附录

参考文献

致谢

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