靶向FOXM1的小分子抑制剂抑制卵巢癌细胞增殖的作用及机制

摘要

卵巢癌是女性生殖器官三大恶性肿瘤之一，其死亡率位居女性生殖器官三大恶性肿瘤之首，卵巢癌发病比较隐秘，因其早期不易被发现，所以大约75％的患者确诊时已是晚期，且其生存力低下，预后差。复发是卵巢癌治疗失败、患者死亡的主要原因之一。目前卵巢癌治疗方法主要采用肿瘤细胞减灭术联合铂类药物化疗的标准方案，但至今，耐药现象频频发生，给肿瘤治疗带来了极大的挑战。近年来，随着医学分子生物学理论及其生物学技术的快速发展，采用小分子靶向治疗成为医学界关注的热点。全球治疗卵巢癌药物不断研制成功，并且治疗效果显著。例如，在格鲁吉亚和亚美尼亚完成注册的小分子药物人参皂苷，该小分子化合物不仅能够显著抑制卵巢癌细胞的快速增长并且诱导癌细胞发生凋亡，且分子靶向治疗具有高特异性、高效性、低毒性等特点。因此，小分子靶向治疗具有良好的应用前景。
　　FOXM1分子被评为2010年“年度分子”，是Fox转录因子家族成员之一，含有一段保守的DNA结构域，人的转录因子FOXM1基因位于12pl3.3，含有10个外显子，根据Ⅴa和Ⅶa两个外显子的不同连接方式，形成了3个FOXM1分子亚型，分别为FOXM1a、FOMX1b、FOXM1c。随着对FOXM1基因的不断研究，人们发现FOXM1基因与细胞增殖关系密切，且参与细胞分化、细胞衰老、干细胞生长、细胞代谢、肿瘤形成等生物学过程。近几年研究发现，许多肿瘤中如白血病、乳腺癌、胃癌、肺癌等实体肿瘤中FOXM1异常高表达，近几年，大量的生物芯片以及实验研究表明FOXM1基因在卵巢癌中高表达，FOXM1在卵巢癌中的表达水平为正常组织的4-6倍，晚期患病患者FOXM1扩增率增加。FOXM1与卵巢癌的发生发展以及预后有着密不可分的关系。随着研究的深入，FOXM1蛋白三维晶体结构被报道，使得根据分子结构进行特异性药物筛选成为可能。因此，FOXM1有望成为一个潜在的肿瘤治疗新靶点。综上所述，本课题基于FOXM1蛋白三维空间结构，筛选出能够靶向FOXM1的抗肿瘤小分子化合物，并对其抑制卵巢癌细胞生长的分子机制进行初步的研究。
　　1.靶向FOXM1的小分子化合物的虚拟筛选以及化合物XST-20的确定。
　　我们首先从PDB数据库下载FOXM1蛋白的DNA结合区域(DBD)(3G73)，利用Discovery Studio3.0中Prepare Protein模块对蛋白进行处理，寻找靶蛋白可能的小分子结合口袋，对结合口袋进行计算，预测配体与蛋白质结合结构，发现潜在的关键氨基酸，对SPECS数据库中的20万个分子依次进行Libdock和CDOCKER虚拟对接计算，通过对小分子打分，剔除易脱靶的分子，再通过ADMET进行药代动力学性质预测，最终得个27小分子化合物。通过MTT增殖实验检测27个化合物的生物活性，结果显示27个化合物中筛选出8个小分子，通过qRT-PCR、Western blotting技术检测小分子对靶蛋白下游靶基因的影响，结果显示XST-20能够抑制FOXM1下游靶基因CCNB1的表达。我们通过物理方法SPR实验以及分子生物学实验双荧光素酶报告基因实验检测化合物XST-20与FOXM1结合能力。结果显示XST-20能够与FOXM1显著结合。
　　2.小分子化合物XST-20抑制人卵巢癌细胞增殖的分子机制研究。
　　为了证实XST-20是否具有生物学活性，我们在体外应用MTT试验以及平板克隆形成实验评估XST-20对卵巢癌细胞增殖能力的影响，结果显示XST-20可以显著抑制卵巢癌细胞的生长。进一步MTT结果显示小分子化合物XST-20抑制肿瘤细胞活性具有普遍性。小分子化合物的安全性评估，与药效学同等重要，候选小分子化合物的潜在成药性需要通过评估毒性实现，通过毒力实验结果显示小分子化合物XST-20对FTE-187（正常输卵管上皮细胞）细胞的毒性显著低于肿瘤细胞，且具有统计意义。采用流式细胞、Western blotting技术检测了XST-20对卵巢癌细胞周期、凋亡、自噬的影响，结果显示小分子化合物XST-20可以诱导卵巢癌细胞发生G1期停滞，且呈浓度梯度以及时间梯度依赖性。实验结果显示XST-20处理卵巢癌细胞后其促凋亡基因Bax蛋白表达升高;抗凋亡基因bcl-2蛋白表达降低;自噬相关基因LC3-Ⅱ、Atg7、Beclin基因蛋白表达水平升高，因此小分子化合物XST-20可以诱导卵巢癌细胞发生凋亡与自噬。
　　研究结论:
　　1.通过计算机虚拟筛选技术筛选得到小分子化合物，通过SPR技术验证XST-20与FOXM1蛋白DNA结合区域的亲和力。
　　2.XST-20能够显著抑制人卵巢癌细胞生长，并呈时间和剂量依赖性。
　　3.初步探索了XST-20对正常输卵管上皮FTE-187细胞的毒性研究，其毒力显著低于卵巢癌细胞。
　　4.XST-20能够显著诱导卵巢癌细胞发生G1期停滞，并呈时间和剂量依赖性，初步探讨了XST-20能够诱导卵巢癌细胞发生显著自噬与凋亡。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

1．实验材料

2．实验方法

结果

1．基于FOXM1蛋白的虚拟筛选结果

2．分子生物学试验筛选结果

3．XST-20抑制卵巢癌细胞增殖的机制研究

讨论

结论

课题展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文和参与课题情况