人脐带间充质干细胞对高糖状态下足细胞固有免疫反应的影响

摘要

糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是导致终末期肾病(End stage renaldisease，ESRD)的主要原因之一，其确切发病机制目前尚未完全阐明。近年研究表明，糖尿病时血生化和血流动力学改变等因素所引起的自身固有免疫和炎性反应在DN的发生发展中有重要作用。固有免疫作为机体免疫系统的第一道防线，主要通过模式识别受体（Pattern recognition receptor，PRR）识别在进化上高度保守的病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular pattern，PAMP)以及组织、细胞在受到损伤后所释放的具有免疫活性调节作用的损伤相关分子模式(Damage-associated molecular pattern，DAMP)，如热休克蛋白(Heat shockproteins，HSP)、细胞外基质的降解产物、高迁移率族蛋白1（High-mobilitygroupbox1，HMGB1）、自身的核酸成分等。Toll样受体(Toll-likereceptors，TLR)是固有免疫调控系统的主要组成部分，糖尿病状态下，高糖、脂质代谢紊乱和缺氧等因素可诱导机体产生多种内源性配体，TLR与其相互识别即可激活固有免疫，从而诱发炎性反应。间充质干细胞(Mesenchymal stemcells，MSCs)具有多向分化能力，可以减轻DN的发展进程，但具体机制尚不明确。本研究通过高糖刺激足细胞，以激活TLR2和TLR4介导的固有免疫通路诱发炎性反应，并通过将人脐带间充质干细胞(Human umbilicalcordmesenchymal stem cells，HUC-MSCs)与足细胞共培养，探究干细胞对固有免疫的影响以及对高糖状态下足细胞炎性反应的调控。
　　目的:
　　探讨人脐带间充质干细胞(HUC-MSCs)对高糖状态下TLR介导的足细胞固有免疫反应的影响。
　　方法:
　　1.从足月新生儿脐带中提取人脐带间充质干细胞。
　　2.流式细胞术鉴定人脐带间充质干细胞的表型，应用成骨诱导培养基和成脂诱导培养基诱导人脐带间充质干细胞的分化。
　　3.将足细胞分为3组:正常糖浓度组(NG)、甘露醇组（NG+MA）、高糖浓度组(HG)，相同条件下培养96h，并分别在24h、48h、72h、和96h应用CCK8测定各组足细胞的活性变化。
　　4.将足细胞分为4组:正常糖浓度组(NG)、甘露醇组(NG+MA)、高糖浓度组(HG)、高糖浓度下足细胞与HUC-MSCs共培养组(HG+MSC)。刺激72 h后，ELISA方法检测各组培养基上清中炎性因子IL-6、IL-β、TNF-α、MCP-1以及TLR配体HSP70、HMGB1的表达，实时定量PCR法检测各组细胞表面及细胞提取物中TLR2、TLR4的mRNA表达，Western印迹法检测TLR2、TLR4、MyD-88依赖型信号通路中TLR2、TLR4、MyD-88、p-P65的蛋白表达，免疫荧光染色法观察p-P65在足细胞内的定位情况。
　　结果:
　　1.人脐带间充质干细胞的鉴定:
　　1.1 流式细胞术检测结果显示，HUC-MSCs高表达人间充质干细胞标志物CD73、CD90，低表达造血细胞标志物CD34、CD45。
　　1.2 经成骨诱导分化后，茜素红染色显示细胞质中有钙沉积，提示HUC-MSCs已经分化为成骨细胞;
　　1.3 成脂诱导分化后，行油红O染色显示细胞质有红色油滴空泡，提示HUC-MSCs已经分化成为脂肪细胞;
　　2.高糖刺激使足细胞活性降低并且随刺激时间的延长其活性降低更加明显。
　　3.4组细胞按分组条件培养72h后:
　　3.1 与NG组比较，ELISA法检测HG组炎性因子IL-6、IL-β、TNF-α、MCP-1表达明显增多（均P＜0.05）。TLR配体HSP70、HMGB1的蛋白表达增多（均P＜0.0S）。实时定量PCR法和蛋白印迹法检测TLR2、TLR4的mRNA和蛋白水平增加（均P＜0.05），MyD-88及p-P65蛋白表达增多（均P＜0.05），免疫荧光染色可见p-P65核内转移。
　　3.2 与HG组比较，HG+MSC组炎性因子IL-6、IL-β、TNF-α、MCP-1以及TLR配体HSP70、HMGB1蛋白表达减少(均P＜0.05)，TLR2、TLR4 mRNA和蛋白水平减少，MyD-88、p-P65的蛋白表达减少（均P＜0.05），免疫荧光染色示p-P65核内转移不明显。
　　结论:
　　1.高糖刺激使足细胞活性降低。
　　2.高糖刺激可使TLR介导的足细胞固有免疫反应增强。
　　3.HUC-MSCs共培养可通过抑制TLR通路，减轻免疫反应。

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实验材料

实验方法

统计学分析

实验结果

讨论

主要结论

不足与展望

附图

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致谢

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