p75NTR对小鼠坐骨神经损伤后神经再生的影响及其作用机制研究

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分 小鼠坐骨神经挤压伤后p75NTR的表达变化特点
　　目的：
　　通过观察野生型C57BL/6雄性小鼠在坐骨神经挤压伤后不同时间点神经损伤部位p75NTR表达，探讨坐骨神经损伤后p75NTR表达的时序化特点，为进一步研究坐骨神经损伤后p75NTR对神经再生的影响及其作用机制提供理论基础。
　　方法：
　　选取野生型C57BL/6雄性小鼠42只，随机分为假手术组和模型组，每组各21只。采用异氟烷吸入麻醉，模型组使用显微无齿血管钳在坐骨结节远端5mm处钳夹坐骨神经，神经钳夹受力点位于血管钳尖端1/3处，定量压1扣，持续时间60s，制作坐骨神经挤压伤模型，假手术组仅暴露坐骨神经，但无神经钳夹。根据坐骨神经挤压伤造模时间分为成模前、成模后0天、3天、7天、14天、21天、28天等7个时间点，分别在各时间点取坐骨神经损伤区组织标本，采用RT-qPCR和Western-Blot方法检测p75NTR mRNA和蛋白表达量。
　　结果：
　　模型组在坐骨神经挤压伤后p75NTR mRNA和蛋白表达上调，其表达水平与坐骨神经挤压伤后时间有关。成模前假手术组与模型组p75NTR mRNA和蛋白表达水平无显著性差异(P＞0.05)，但模型组在成模第3天p75NTR mRNA表达水平升高，在成模第7天p75NTRmRNA表达至峰值，然后其表达水平逐渐降低，在成模第21天p75NTRmRNA表达水平降至成模前水平(P＞0.05)，在成模第3天、7天、14天p75NTR mRNA表达高于假手术组(P＜0.01)。模型组在成模第3天p75NTR蛋白表达水平明显升高，在成模第14天p75NTR蛋白表达至峰值，然后其表达水平逐渐降低，在成模第3天、7天、14天、21天p75NTR蛋白表达高于假手术组（P＜0.01），在成模第28天p75NTR蛋白表达水平降至成模前水平（P＞0.05）;假手术组在各时间点p75NTRmRNA和蛋白表达水平无明显差异(P＞0.05)。
　　结论：
　　在小鼠坐骨神经挤压伤后p75NTR表达上调，其表达量与坐骨神经挤压伤后时间有关。在坐骨神经挤压伤后第3天开始出现p75NTR mRNA和蛋白表达上调，在神经损伤后第7天p75NTR mRNA表达至峰值，其表达上调持续至损伤后第21天;而p75NTR蛋白在神经损伤后第14天表达至峰值，其表达上调持续至损伤后第28天。
　　第二部分 p75NTR促进小鼠坐骨神经挤压伤后神经再生的作用机制
　　目的：
　　通过观察C57BL/6野生型雄性小鼠和p75NTR基因敲除雄性小鼠坐骨神经挤压伤第14天神经元内在生长相关分子和神经髓鞘再生相关蛋白表达，同时观察坐骨神经损伤远端神经轴突髓鞘化程度，探讨p75NTR对坐骨神经损伤后神经再生的作用机制。
　　方法：
　　选取p75NTR基因敲除(p75NTR-/-，胞外段外显子Ⅲ敲除)伴有C57BL/6遗传背景雄性小鼠与野生型(p75NTR+/+)雌性C57BL/6小鼠交配扩群，使用PCR法鉴定子代基因型。筛选出野生型雄性小鼠(p75NTR+/+)小鼠30只，随机分为假手术组和模型组，每组各15只;另随机选取p75NTR基因敲除型雄性小鼠(p75NTR-/-)15只为p75NTR-/-组。模型组和p75NTR-/-组使用显微无齿血管钳钳夹坐骨神经制作神经挤压伤模型，假手术组仅暴露坐骨神经，但无神经钳夹。造模第14天，取3组小鼠L4-L5段脊髓标本，分别采用RT-qPCR、Western-Blot检测神经元内在生长相关分子c-Jun、STAT-3、Gap-43及CREB mRNA及蛋白表达量，采用ELISA方法检测脊髓cAMP浓度;取坐骨神经挤压损伤区神经组织标本，采用Western-Blot方法检测p75NTR蛋白表达量，RT-qPCR和Western-Blot方法检测髓鞘再生相关蛋白Mbp、Mpz及Mag的mRNA及蛋白表达量;使用透视电镜观察损伤部位远端轴突髓鞘化比率、g比率和有髓轴突髓鞘厚度分布。
　　结果：
　　1.在坐骨神经挤压伤成模第14天，模型组坐骨神经损伤组织p75NTR蛋白的表达上调，明显高于假手术组，差异有统计学意义(P＜0.01);而p75NTR-/-组未检测到p75NTR蛋白表达。
　　2.在坐骨神经挤压伤成模第14天，模型组神经损伤区Mbp mRNA、MpzmRNA及Mag mRNA表达水平明显高于假手术组(P＜0.01)，而p75NTR-/-组Mbp mRNA、Mpz mRNA及Mag mRNA呈低水平表达，其表达水平明显低于模型组(P＜0.01);模型组Mbp、Mpz及Mag蛋白表达水平高于假手术组（P＜0.01)，p75NTR-/-组Mbp、Mpz及Mag蛋白表达水平明显低于模型组(P＜0.01)。模型组L4-L5脊髓神经元内在生长相关分子c-Jun mRNA、STAT-3 mRNA、Gap-43 mRNA及CREB mRNA表达水平略高于假手术组，但差异无统计学意义（P＞0.05），且p75NTR-/-组与模型组比较无显著差异(P＞0.05);上述分子蛋白表达情况与其mRNA表达一致。ELISA检测小鼠L4-L5脊髓cAMP浓度，模型组与p75NTR-/-组比较无显著差异（P＞0.05）。模型组神经营养因子BDNFmRNA和GDNF mRNA表达高于假手术组（P＜0.05），但模型组与p75NTR-/-组比较无显著差异(P＞0.05)。
　　结论：
　　p75NTR参与坐骨神经挤压伤后损伤部位髓鞘再生相关分子Mbp、Mpz及Mag的表达上调，提高损伤神经远端髓鞘化程度，减轻损伤神经远端去神经化;而p75NTR对损伤神经的调节作用与cAMP、c-Jun、STAT-3、Gap-43及CREB参与的神经元内在生长能力调节信号途径不同，且与脊髓神经营养因子BDNF、GDNF表达上调无关。
　　第三部分 p75NTR对坐骨神经挤压伤小鼠行为学的影响
　　目的：
　　通过观察C57BL/6野生型小鼠和p75NTR基因敲除小鼠在坐骨神经挤压伤后坐骨神经功能指数、趾展试验、斜板试验及针刺分区感觉评分等行为学功能变化，探讨p75NTR对小鼠坐骨神经挤压伤后行为学的影响。
　　方法：
　　选取C57BL/6野生型（p75NTR+/+）雄性小鼠20只，随机分为假手术组和模型组，每组各10只;另随机选取p75NTR基因敲除型（p75NTR-/-）雄性小鼠10只为p75NTR-/-组。模型组和p75NTR-/-组使用显微无齿血管钳钳夹坐骨神经制作坐骨神经挤压伤模型，假手术组仅暴露坐骨神经，无坐骨神经钳夹。分别检测成模前和成模后不同时间点各组小鼠坐骨神经功能指数(SFI)、趾展试验评分、斜板试验及针刺感觉分区评分等行为学变化。
　　结果：
　　1.在成模第7天模型组SFI为(67.4±7.8)、p75NTR-/-组为-(75.9±8.1)、假手术组为-(14.2±5.5)，模型组与假手术组比较有显著差异(P＜0.01)，且模型组高于p75NTR-/-组(P＜0.05);在成模第14天模型组SFI为-(50.6±7.5)高于p75NTR-/-组-（65.9±8.3）(P＜0.01);在成模后21天、28天、35天两组SFI比较，模型组均高于p75NTR-/-组(P＜0.05或P＜0.01)。
　　2.p75NTR-/-组小鼠趾展试验恢复正常化的时间较模型组延迟1周，模型组初始反应时间为（10.2±1.2）天较p75NTR-/-组（15.3±1.6）天明显缩短(P＜0.01)，模型组完全反应时间为(17.1±1.9)天短于p75NTR-/-组（24.7±2.5）天(P＜0.01)。
　　3.在成模第7天模型组小鼠斜板试验角度为（41.5±4.2）°、p75NTR-/-组为(36.8±3.4)°、假手术组为（59.2±3.7）°，模型组与假手术组比较有显著差异(P＜0.01)，且p75NTR-/-组斜板试验角度低于模型组(P＜0.05);成模14天开始模型组斜板试验角度逐渐升高，在成模第14天、21天、28天、35天各时间点模型组斜板试验测试角度均明显高于p75NTR-/-组（均P＜0.01）。
　　4.p75NTR-/-组小鼠针刺感觉分区评分全部恢复正常化的时间为34天，较模型组延迟14天;模型组针刺感觉分区评分初始反应时间为（9.8±1.6）天较p75NTR-/-组（17.6±2.1）天明显缩短(P＜0.01)，模型组完全反应时间为(15.1±1.9)天短于p75NTR-/-组(27.3±2.5)天(P＜0.01)。
　　结论：
　　p75NTR基因敲除小鼠坐骨神经挤压伤后多项行为学检测指标包括坐骨神经功能指数、趾展试验评分、斜板试验和针刺感觉分区评分均差于野生型小鼠，说明p75NTR能促进小鼠坐骨神经损伤后行为学功能恢复。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 P75NTR在小鼠坐骨神经损伤后的表达变化特点

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4．结论

第二部分 p75NTR促进坐骨神经损伤后神经再生的作用机制

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第三部分 p75NTR对小鼠坐骨神经挤压伤后行为学的影响

1．材料和方法

2．结果

3 讨论

4．结论

全文结论

附图

参考文献

致谢

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