MALAT1-EZH2-NOTCH1轴对小鼠TBI后血管重塑及神经再生的作用及其机制研究

摘要

目的： MALAT1在进化上是一种高度保守的长链非编码 RNA（LncRNA），其首先被证明与肺部肿瘤转移相关，机制可能是促进血管生成。最近研究表明，活化的血管系统可通过分泌神经营养因子，例如BDNF、Ang-1和SDF-1α，促进神经再生。本课题研究MALAT1在创伤性脑损伤（TBI）后血管重塑和神经再生中的作用及其机制。 方法2： 第一部分 MALAT1对血管再生的作用及机制研究。 实验一：MALAT1对血管再生的作用研究。 体外实验：在OGD后24小时，通过慢病毒抑制MALAT1后，进行细胞增殖、迁移和血管形成实验。将细胞随机分成2组：OGD+空白对照和OGD+ LV siMALAT1(100 MOI1μl/100μl)。N=4/组。 在体实验：在CCI后第7天，通过腺相关病毒抑制MALAT1后，进行CD31/Brdu和Lectin的免疫组织化学染色。将小鼠随机分为2组：CCI+空白对照和CCI+ AAV siMALAT1（4μl/小鼠）。N=5/组。 实验二：MALAT1对血管再生的机制研究（一）。 在体实验：为了动态检测MALAT1、EZH2和NOTCH1的变化情况，我们在TBI损伤后6小时和第1、3、7、14、21和28天，进行了PCR实验。将小鼠随机分为2组：假手术组和CCI组，N=4/时间点。在CCI后第7天，通过FISH实验对MALAT1进行定位。 体外实验：在 OGD后48小时，也通过 PCR检测了内皮细胞MALAT1的表达水平。将细胞随机分成2组：对照组和OGD组。在OGD后，通过RNA pull-down鉴定MALAT1和EZH2之间的相关性。N=4/组。 生物信息学：通过两种生物信息学软件-RNA-protein interaction和Starbase，进一步预测MALAT1与EZH2之间的关系。 实验三：MALAT1对血管再生的机制研究（二）。 体外实验：在OGD后24小时后，通过过表达EZH2、活化NOTCH1通路，与下调MALAT1联合干预，进行细胞增殖、迁移和血管形成实验。将细胞随机分成3组：OGD+空白对照、OGD+ LVsiMALAT1（100 MOI1μl/100μl）和OGD+ LVsiMALAT1（100 MOI1μl/100μl）+pcEZH2（10μg/100μl)）或Jagged-1（1μg/100μl）。N=4/组。 体内实验：在CCI后第7天，通过过表达EZH2、活化NOTCH1通路，联合下调MALAT1双重干预后，进行CD31/Brdu和Lectin的免疫组织化学染色。将小鼠随机分为4组：CCI+空白对照、CCI+AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）、CCI+ AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）+Jagged-1（1 ng/ml）和CCI+AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）+ pcEZH2。N=5/组。 实验四：MALAT1对血管再生的机制研究（三）。 体外实验：抑制MALAT1后，检测EZH2、NOTCH1、HES1的蛋白水平。将细胞随机分成2组：OGD+空白对照和OGD+LVsiMALAT1（100 MOI1μl/100μl）。N=4/组。（HES1为NOTCH1通路下游蛋白）。 体外实验：抑制EZH2后，检测NOTCH1的蛋白水平。将细胞随机分成2组：OGD+空白对照和OGD+ GSK126（100μM）。N=4/组。 体外实验：过表达 EZH2联合下调 MALAT1双重干预后，检测NOTCH1、HES1的蛋白水平。将细胞随机分成3组：OGD+空白对照、OGD+ LV siMALAT1（100 MOI1μl/100μl）和OGD+ LV siMALAT1（100 MOI1μl/100μl）+ pcEZH2（10μl/100μl）。N=4/组。 实验五：通过 MALAT1的核酸抑制剂，验证 MALAT1对血管重塑的作用。 体外实验：在OGD后24小时，通过LNA GampeR抑制MALAT1后，进行细胞增殖、迁移和管腔形成实验。将细胞随机分为2组：OGD+空白对照和OGD+ LNA GampeR MALAT1（100 nmol/L）。N=4/组。 在体实验：在CCI后第7天，通过LNA GampeR抑制MALAT1后，进行CD31/Brdu和Lectin的免疫组织化学染色。将小鼠随机分为2组：CCI+空白对照和CCI+ LNA GampeR MALAT1（2 mg/kg）。N=5/组。 第二部分 MALAT1对神经再生的作用及机制研究。 实验一：MALAT1对神经再生的作用研究。 在体实验：神经干细胞增殖、成神经细胞迁移和神经元增殖是神经再生的重要标志。我们于CCI后第7天，通过AAV抑制MALAT1后，进行免疫组化染色Nestin、DCX/Brdu和NeuN/Brdu，对神经生成进行检测。将小鼠随机分成2组：CCI+空白对照和CCI+AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）。N=5/组。 实验二：MALAT1对神经再生的机制研究。 在体实验：在活化NOTCH1通路联合下调MALAT1双重干预后，通过免疫组织化学检测神经再生。将小鼠随机分成3组：CCI+空白对照、CCI+ AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）和CCI+ AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）+ Jagged-1（1 ng/ml）。N=5/组。 第三部分血管再生对神经再生的作用研究。 实验一：MALAT1-EZH2-NOTCH1通路对SDF-1α的作用研究。 体外实验：抑制MALAT1后，检测内皮细胞三种分泌因子SDF-1α、Ang1和BDNF的蛋白水平。将细胞随机分成2组：OGD+空白对照和OGD+ LVsiMALAT1（100 MOI1μl/100μl）。N=4/组。 体外实验：过表达 EZH2联合下调 MALAT1双重干预后，检测SDF-1α、Ang1和BDNF的蛋白水平。将细胞随机分成3组：OGD+空白对照、OGD+ LV siMALAT1（100 MOI1μl/100μl）和OGD+ LV siMALAT1（100 MOI1μl/100μl）+ pcEZH2（10μl/100μl）。N=4/组。 体外实验：活化 NOTCH1通路联合下调 MALAT1双重干预后，检测SDF-1α，Ang1和BDNF的蛋白水平。将细胞随机分成3组：OGD+空白对照、OGD+ LV siMALAT1（100 MOI1μl/100μl）和OGD+ LV siMALAT1（100 MOI1μl/100μl）+ Jagged-1（1μg/100μl）。N=4/组。 实验二：SDF-1α对神经再生的作用研究。 在体实验：CCI后第7天，抑制SDF-1α后通过免疫组织化学检测神经再生。将小鼠随机分成2组：CCI+空白对照（生理盐水1 mg/kg）和CCI+ AMD3100（1 mg/kg）。N=5/组。 实验三：MALAT1-SDF-1α轴对神经再生的作用研究。 在体实验：CCI后第7天，使用重组蛋白质 SDF-1α联合下调MALAT1双重干预后，通过免疫组织化学检测神经再生。将小鼠随机分成3组：CCI+空白对照、CCI+ AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）和CCI+ AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）+ SDF-1α（1 ng/ml/小鼠）。N=5/组。 第四部分 MALAT1对脑血流灌注及神经功能的作用研究。 实验一：MALAT1对脑血流灌注的作用研究。 在体实验：抑制MALAT1后，通过PSI监测血流变化，对脑血流灌注进行评估。将小鼠分成3组：CCI+空白对照、CCI7d+AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）和CCI10d+ AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）。 实验二：MALAT1对神经功能的作用研究。 在体实验：过表达EZH2联合下调MALAT1双重干预后，通过NSS、抓线测试、Morris水迷宫实验对神经功能进行评估。将小鼠随机分成4组：假手术组、CCI+空白对照、CCI+ AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）和CCI+ AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）+ pcEZH2（6μl/小鼠）。N=6/组。 实验三：MALAT1对TBI伤灶体积的影响。 在体实验：抑制MALAT1后，通过HE染色对伤灶体积进行检测。将小鼠分成2组：CCI+空白对照和CCI+ AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）。N=5/组。 实验四：MALAT1的副作用研究。 在体实验：抑制MALAT1后，通过ELISA检测TBI后急、慢性期炎性细胞因子TNF-α、IL-6和 IL-1β的表达水平。将小鼠随机分成6组：假手术组+空白对照、假手术组+ AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）、CCI3d+空白对照、CCI3d+ AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）、CCI21d+空白对照和CCI21d+ AAVsiMALAT1（4μl/小鼠）。N=5/组。 由于技术上的限制，目前尚无法构建MALAT1的过表达载体，我们只能通过抑制MALAT1表达，进行反面的理论验证。 结果： 第一部分 MALAT1对血管再生的作用及机制研究。 实验一：体外实验发现，抑制MALAT1后，血管腔管的形成、内皮细胞的增殖受到抑制，但是内皮细胞的迁移增强（P<0.05）。在体实验发现，抑制MALAT1后，CCI后的内皮细胞增殖和功能血管密度也受到明显抑制（P<0.05）。 实验二：在体实验发现，与假手术组相比，CCI后6小时，MALAT1水平明显升高（P<0.05），第14天仍然维持在较高水平（P<0.05）。CCI后，EZH2和NOTCH1的RNA水平变化，显示出与MALAT1相似的趋势。RNA-FISH显示，小鼠脑内存在大量与MALAT1具有免疫反应活性的血管内皮细胞。 体外实验发现，OGD后24小时，内皮细胞中MALAT1水平显著升高（P<0.05）。RNA pull-down实验证明，在内皮细胞中MALAT1可与EZH2相互结合。通过RNA-protein interaction prediction (http://pridb.gdcb.iastate. edu/RPISeq/)软件预测了MALAT1与RNA结合蛋白之间的结合概率，发现MALAT1结合EZH2的可能性极高（RF或[SVM]分值>0.5）。Starbase软件也提供了类似的证据。这些数据表明在转录水平上，MALAT1可通过表观遗传学调控潜在的靶基因表达。 实验三：体外实验发现，抑制MALAT1联合过表达的EZH2或活化的NOTCH1通路，逆转了siMALAT1介导的抑制内皮细胞增殖、管腔形成和促进细胞迁移作用（P<0.05）。我们在补充实验中也证明，抑制EZH2和NOTCH1通路12小时和24小时后，内皮细胞增殖均受到明显抑制（P<0.05）。 在体实验发现，CCI后MALAT1对内皮细胞增殖和功能血管密度的促进作用，也被过表达 EZH2或激活 NOTCH1信号通路联合MALAT1下调双重干预所逆转（P<0.05）。 实验四：体外实验发现，抑制MALAT1后，内皮细胞中EZH2和NOTCH1的蛋白质水平显著下降（P<0.05）。此外，抑制EZH2后， NOTCH1信号通路亦被抑制（P<0.05）。另外，过表达EZH2联合下调MALAT1，逆转了siMALAT1介导的NOTCH1和HES1抑制效应（P<0.05）。 实验五

目录

英汉缩略语名词对照

前言

参考文献

第一部分 MALAT1对血管再生的作用及机制研究

1材料及方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第一部分附图

第二部分 MALAT1对神经再生的作用及机制研究

1材料及方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第二部分附图

第三部分 血管再生对神经再生的作用研究

1材料及方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第三部分附图

第四部分 MALAT1对脑血流灌注及神经功能的作用研究

1材料及方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第四部分附图

全文总结

全文总结附图

文献综述:LncRNA MALAT1的临床研究进展

致谢

攻读博士期间撰写发表文章和参加会议