虫草菌粉对矽肺兔转化生长因子-β1及其信号传导通路的影响

摘要

背景：矽肺病主要是由于在生产过程中长期吸入含有二氧化硅较高的粉尘所引起的以肺纤维化病变为主要病变的一种肺部疾病。无论是从接触粉尘的人数还是从新发矽肺病人数及现患病人数来讲，中国都是排在前列。矽肺的发病机理至今还不完全清楚，它可能涉及到由多种细胞及其组分参与的细胞毒作用、局部炎症反应、病态增殖、免疫损伤及修复等多个病理过程，而在其病变发生发展过程中，近年来，大多数学者认为，其起最关键性作用的细胞因子就是TGF-β，其中TGF-β1为TGF-β家族中最重要的致纤维化亚型，而Smad3、Smad7蛋白是 TGF-β-Smads信号通路的下游蛋白，其异常表达在肺纤维化发生发展中发挥着关键作用。
　　矽肺病治疗方法包括药物治疗及大容量肺泡灌洗等，药物治疗包括克矽平、汉防己甲素、维生素E、亚硒梭钠、葡萄酸锌等，然而这些药物疗效已证实不太令人满意，大容量肺泡灌洗虽有一定疗效，但大体上亦不能改变矽肺病的进程，且选例要求较严格，手术风险、手术费用均是患者及家属所要考虑的大问题。寻求新的药物对此病的防治刻不容缓。
　　冬虫夏草用于治疗慢性肺疾病已有千年历史，长期以来被视为珍贵的强壮滋补中药，研究认为冬虫夏草具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、抗炎及抗菌等作用功能。虫草菌粉化学成分和药理作用均与天然虫草相似，系青海产新鲜冬虫夏草中分离所得的虫草菌，此药物已应用于临床多年，对多种疾病包括呼吸系统病均有防治作用，近年来有研究表明，虫草菌粉对肝、肾组织纤维化具有干预作用，亦有个别报道其能抑制肺纤维化的作用，但目前临床上还无其应用于矽肺病防治及其作用机制方面的报道。
　　目的：应用虫草菌粉对矽肺兔模型建立进行干预，并对之进行治疗，通过检测各组兔肺组织病理及羟脯氨酸、TGF-β1、Smad3、Smad7等指标，探讨虫草菌粉在矽肺纤维化过程中对肺的防治作用，并就其对肺防治作用机制进行探讨，为预防和控制矽肺病提供理论依据。
　　方法：实验第一部分：30只雄性大耳白兔随机分为空白对照组、干预组、矽肺组3组，每组10只。从造模前半月干预组每天予以虫草菌粉液喂饮，其余两组以等体积生理盐水喂饮，其它饲养方法相同。干预组和矽肺组从气管内注入二氧化硅粉尘悬液制作矽肺兔模型，空白对照组从气管内注入生理盐水。30d后处死所有兔，测量兔肺干重，制作病理切片，用加碱水解法测定各组兔肺组织的羟脯氨酸含量，应用实时荧光定量 PCR法测各组兔肺组织 TGF-β1mRNA及Smad7mRNA的表达水平；
　　实验第二部分：30只雄性大耳白兔随机分为对照组、模型组、治疗组3组，每组各10只。模型组和治疗组兔气管内注入二氧化硅粉尘悬液制作矽肺兔模型，对照组气管内注入生理盐水。从造模后第30天开始治疗组每天予以虫草菌粉液喂饮，对照组及模型组以等体积生理盐水喂饮，其它饲养方法相同，共计4个月，5个月后处死全部兔。测量肺干重，制作病理切片，用加碱水解法测定各组兔肺组织的羟脯氨酸含量，ELISA法测定支气管肺泡灌洗液中 TGF-β1含量，应用实时荧光定量 PCR法测各组兔肺组织 TGF-β1mRNA、Smad3mRNA及Smad7mRNA的表达水平。
　　结果：实验第一部分：病理切片示空白对照组为正常肺组织，矽肺组见肺组织明显纤维化并有矽结节形成，干预组虽然也有上述改变，但程度较轻；矽肺组、干预组肺干重及肺组织羟脯氨酸的含量高于空白对照组，矽肺组肺干重和肺组织羟脯氨酸的含量高于干预组；矽肺组和干预组兔肺组织 TGF-β1 mRNA表达水平均低于空白对照组，矽肺组兔肺组织TGF-β1 mRNA表达水平低于干预组，矽肺组和干预组兔肺组织 Smad7 mRNA表达水平高于空白对照组，矽肺组兔肺组织Smad7mRNA表达水平高于干预组。(注：TGF-β1 mRNA、Smad7 mRNA表达水平均采用ΔΔCt值进行统计学分析。)
　　实验第二部分：病理切片示对照组为正常肺组织，模型组兔肺可见肺泡结构破坏，可见大量的大小不一的矽结节，以Ⅲ-Ⅳ级矽结节为主，部分融合成片，治疗组主要以肺泡炎及纤维化改变为主，可见大小不一矽结节，但以Ⅰ-Ⅱ为主，未见明显融合，矽结节计数评分模型组高于治疗组，两组比较差异有统计学意义；模型组、治疗组肺干重和肺组织羟脯氨酸的含量高于对照组，差异有统计学意义，模型组肺干重和肺组织羟脯氨酸的含量高于治疗组；模型组和治疗组支气管肺泡灌洗液TGF-β1含量高于对照组，差异有统计学意义；且模型组高于治疗组，差异有统计学意义；模型组、治疗组兔肺组织TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA表达水平均低于对照组，模型组兔肺组织TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA表达水平低于治疗组，模型组、治疗组兔肺组织Smad7 mRNA表达水平高于对照组，模型组兔肺组织Smad7mRNA表达水平高于治疗组。(注：TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad7 mRNA表达水平均采用ΔΔCt值进行统计学分析。)
　　结论：虫草菌粉对矽肺兔肺纤维化有一定的干预作用，其作用机制可能为抑制TGF-β1 mRNA表达上调，依赖于TGF-β1-smads信号通路，使Smad3表达水平下调，Smad7表达水平上调，从而抑制矽肺纤维化的形成，延缓矽肺的进展。

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中英缩略词表

第1章 前言

第2章 材料与方法

2.1 主要仪器设备

2.2 主要药品试剂

2.3 自制材料及溶液

2.4 实验第一部分

2.5 实验第二部分

2.6统计学处理

第3章 结果

3.1实验第一部分

3.2 实验第二部分

第4章 讨论

4.1 虫草菌粉对矽肺兔肺组织病理及羟脯氨酸含量的干预

4.2 虫草菌粉对矽肺兔肺组织TGF-β1及其信号传导通路的影响

4.3 总结

第5章 结论

第6章 展望

致谢

参考文献

附图

攻读学位期间的研究成果

综述: TGF-β1及其信号通路与肺纤维化