用于内耳基因治疗的PLGA包裹的羟基磷灰石基因载体的构建

摘要

背景:内耳后天的感音神经性听力损失常来自于过度的噪音或耳毒性药物所造成听觉上皮毛细胞(Haircell，HC)的损伤，并伴发或继发螺旋神经节神经元(SpiralGanglionNeuron，SGN)的退行性改变。研究发现应用神经营养因子-3（Neurotrophin-3，NT-3）可以保护受损内耳中残存的毛细胞，预防SGNs变性。但这种治疗作用持续给与NT-3，短期使用NT-3后SGNs的远期生存率与不使用者没有显著差别。基因治疗经一次给药后可以持续作用，能避免手术操作的损伤和可能的感染，所以受到了研究者的青睐。本课题组2006年首次利用羟基磷灰石纳米颗粒（Hydroxyapatitenanoparticles，nHAP）将NT-3基因转入豚鼠内耳并成功表达，之后围绕nHAP载体进行了一系列体内外转染实验。但这些实验中nHAP的转染效率不高，转染的特异性不强。因此课题组尝试用有机多聚物修饰nHAP的表面，以提高其转染效率、添加靶向转染的能力。本课题拟通过聚乳酸羟基乙酸共聚物(Poly(lactic-co-glycolicacid)，PLGA）修饰nHAP表面，构建将要用于内耳基因治疗的新型基因载体。
　　目的:构建PLGA包裹的羟基磷灰石基因载体。探索水包油包固体(Solid/Oil/Water，S/O/W)复乳法制备新载体的工艺;探索新载体的转染能力和应用于内耳基因治疗的可能性。
　　方法:通过水热法合成羟基磷灰石纳米颗粒。通过水包油包固体(S/O/W)复乳法制备PLGA包裹的载体。根据复乳法的原理，选取四个关键参数:nnAP加入的质量，PLGA的浓度，超声乳化的持续时间和水相中聚乙烯醇（Polyvinylalcohol，PVA）的浓度。探索它们对新载体尺寸的影响。最后以MTT（噻唑蓝）法测定新载体的细胞毒性，在Hela细胞中完成转染。
　　结果:1）合成所得nHAP的直径为93.9±1.8nm，它在磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersolution，PBS)中能以50∶1的质量比吸附pEGFP-N1质粒(DNA)。
　　2)S/O/W复乳法的四个参数中:
　　nHAP加入质量与载体粒径负相关，其影响有统计学意义(p＜0.05);PLGA浓度与粒径正相关，对载体粒径的影响有统计学意义(p＜0.05);超声能量与载体粒径负相关，其影响有统计学意义(p＜0.05);
　　尽管PVA浓度对产品粒径的影响没有统计学意义(p＞0.05)，但它与PLGA浓度存在显著的交互作用，同时HAP加入质量和PLGA浓度也有交互作用，这两个交互作用对粒径的影响有统计学意义（p均小于0.05），并影响了最优参数的选择。
　　3)S/O/W复乳法制备新载体的最优参数是:加入nHAP20mg/ml，PLGA50mg/ml，超声时间4min(30/10s)，PVA浓度2％。
　　4)成功制备了HAP-DNA-PLGA载体，其粒径为211.9±56.7nm。
　　5)HAP-DNA-PLGA载体的理论载药量为0.571％，实际载药量为0.235±0.03％，药物包裹率(Encapsulationefficiency，EE)为41.2±5.2％。
　　6)MTT实验中，3、6、12和24h等时间点上，HAP-DNA-PLGA载体的细胞存活率都与裸nHAP相当。各个浓度（2mg/ml→125ug/ml）的新载体在几乎所有时间点上的细胞存活率均高于转染浓度下的商用脂质体（lipofectaminreagent2000）。
　　7)新载体转染Hela细胞后，第一天的转染率仅1.93％，第三天增长到了5.51％，而同条件下商用脂质体的转染率从63.40％（第一天）下降到了15.51％（第三天）。
　　结论:通过S/O/W复乳法成功构建了PLGA包裹的羟基磷灰石基因载体。该载体的尺寸合适，载药能力与传统的PLGA载体相当;细胞毒性低予商用脂质体，转染条件宽松，转染率随培养时间的延长而增加，适用于将来受损内耳的基因治疗;而且PLGA外壳为nHAP核心提供了修饰靶向配体的可能。

目录

声明

论文说明

摘要

英文缩略词

前言

1．材料与方法

1．1 实验仪器设备

1．2 实验试剂

1．3 实验方法及步骤

2．实验结果

2．1 nHAP的粒径和电位

2．2 HAP-PLGA的特征和统计

2．3 透射电镜结果

2．4 质粒鉴定结果

2．5 HAP-DNA结合实验

2．6 载体特性

2．7 转染结果

3．讨论

3．1 羟基磷灰石纳米颗粒(nHAP)的制备参数

3．2 Zetasizer测量结果的解释

3．3 S／O／W复乳法的讨论

3．1 DNA电泳的条件

3．2 nHAP与DNA的结合实验

3．3 HAP-DNA-PLGA载体的载药量和包裹率

3．4 细胞毒性实验

3．5 载体转染时细胞的培养条件

3．6 对载体转染特点的理解

3．7 HAP-DNA-PLGA载体的优点和前景

结论

参考文献

以无机物为核心的多功能核酸载体的研究进展

攻读学位期间主要研究成果

致谢