人头发毛囊角质细胞原代培养及其iPS细胞的建立

摘要

目的:
　　(1)建立稳定、高效的人头发毛囊角质细胞原代培养体系，为iPS细胞的基础研究和临床应用提供稳定的细胞来源。
　　(2)建立诱导人头发毛囊角质细胞重编程的技术体系，为建立病人特异性的iPS细胞奠定技术平台。
　　方法:
　　1.采用贴壁法和酶消化法分离人头发毛囊角质细胞，并使用有饲养层培养法和无饲养层培养法在体外进行原代培养。
　　2.RT-PCR鉴定人毛囊角质细胞CK14的表达。
　　3.使用单双酶切鉴定慢病毒质粒。
　　4.慢病毒的包装及病毒产生的鉴定。
　　5.使用慢病毒感染人头发毛囊角质细胞。
　　6.iPS细胞的鉴定:
　　通过形态学观察、RT-PCR、核型鉴定、Western blotting实、碱性磷酸酶底物染色等技术方法检测iPS的生物学特性;并检测本室新克隆的在人ES细胞中特异性高表达的人类新基因ESRG(humanembryonic stem cells related gene，ESRG)在人头发毛囊角质iPS细胞中的表达。
　　结果:
　　1.采用有饲养层和无饲养层培养方法培养人头发毛囊角质细胞。通过RT-PCR鉴定结果表明体外原代培养的人毛囊角质细胞表达CK14基因。
　　2.首次采用饲养层贴壁培养法，使人头发毛囊角质细胞的原代培养成功率达到80％。
　　3.使用单双酶切鉴定后，通过凝胶电泳图显示，各个质粒条带的大小与质粒信息一致。
　　4.将病毒包装质粒与目的质粒共转染293T细胞，24～48h后在倒置荧光显微镜下可观察到EGFP蛋白荧光、合包体和细胞融合现象，表明细胞正在产生病毒。
　　5.用293T细胞模型验证慢病毒系统能正常高效地表达。
　　6.用慢病毒载体法重编程人头发毛囊角质细胞，第15天开始，可见到人ES细胞样的克隆出现。
　　7.通过检测，所得的iPS细胞具有以下生物学特征:
　　(1)具有人ES细胞形态特征;
　　(2)内源性表达ES细胞特有的标志基因;
　　(3)表达ES细胞标志蛋白Oct4和Sox2;
　　(4)表达新基因ESRG;
　　(5)碱性磷酸酶染色呈阳性;
　　(6)具有体外分化形成囊性拟胚体的能力;
　　(7)具有正常的二倍体核型。
　　结论:
　　1.建立了稳定、高效的人头发毛囊外根鞘角质细胞原代培养体系，为iPS实验研究提供了便捷的细胞来源。
　　2.通过携带Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的慢病毒载体可以将人头发毛囊角质细胞重编程成为iPS细胞，具备人ES细胞的各种生物学特性。在体外培养和传代过程中能够维持这些生物学特性。
　　上述实验结果初步证明我们已经建立了人头发毛囊角质iPS细胞系，为将来人头发毛囊角质细胞来源的iPS细胞实验研究和临床应用奠定了技术平台。