DNA甲基转移酶1在结直肠癌DNA甲基化中作用机制的研究

摘要

目的：
　　结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是消化道常见的恶性肿瘤，其发病率高居各种恶性肿瘤第三位，在肿瘤致死的病因中居第四位。2008年全球新增癌症患者1270万人，其中绝大部分发生在发展中国家。结直肠癌发病率和死亡率居高不下的原因之一就是缺乏行之有效的早期检测和治疗方法。近年来随着表观遗传学的兴起，发现DNA甲基化不仅参与体内多种重要的生理过程，而且在众多肿瘤的发生和发展中起着重要的作用，被公认为是肿瘤常见的表观遗传学改变之一。介于肿瘤相关的甲基化事件有望成为结直肠癌防治中的重要分子靶标，因此，深入探讨DNA甲基化与结直肠癌发生、发展的分子机制，对于寻求结直肠癌的临床早期诊断、治疗和预防的新途径都具有重要的指导意义。
　　基于上述研究现状，本研究拟从DNMT1切入，首先检测DNMT1和T-cadherin蛋白在人结直肠癌组织和相应癌旁组织的表达情况，分析结直肠癌及癌旁组织中DNMT1和T-cadherin蛋白表达水平与临床和病理的相关性。进一步在基因水平上探讨人结直肠癌组织中DNMT1mRNA的表达和T-cadherin的甲基化状况，分析其与结直肠癌发生发展的关系。接着用技术，检测DNMT1siRNA干扰对结直肠癌细胞株DNMT酶活性的作用，明确DNMT1siRNA对结直肠癌DNA甲基化水平的影响。最后探讨DNMT1siRNA靶向性沉默DNMT1基因对结肠癌细胞凋亡及其相关基因CDNK1A、T-cadherin、Bcl-2和Bax的mRNA表达的影响，明确DNMT1siRNA对结肠癌细胞凋亡影响的分子机制。
　　方法:
　　1.收集2009年10月到2011年1月湘雅二医院手术切除的36例结直肠癌患者的结直肠癌组织和相应的癌旁组织，同时收集患者临床资料，所有病例确诊为腺癌。采用链霉素抗生物素-过氧化酶(SP)免疫组织化学法检测结直肠癌和相应癌旁组织中DNMT1和T-cadherin蛋白表达，DNMT1在细胞核染色判定为阳性，T-cadherin在细胞膜染色判定为阳性。每张切片在高倍镜视野下，随机计数至少500个细胞，计算阳性细胞数占总细胞数的百分率。
　　2.RT-PCR检测DNMT1基因mRNA表达情况，利用甲基化特异性PCR方法检测T-cadherin基因启动子区甲基化状况，分析结直肠癌中DNMT1mRNA的表达与T-cadherin基因启动子甲基化状况及两者之间的相关性。
　　3.采用脂质体法DNMT1siRNA瞬时转染人结肠癌HT-29细胞，实验分为空白对照组、阴性siRNA（15nM）组、阴性siRNA(31nM)组、DNMT1siRNA（15nM）组、、DNMT1siRNA(30nM)组，转染48小时候收集细胞，分别提取DNA、总RNA和蛋白质（共5组），RT-PCR检测DNMT1基因mRNA的表达情况，WB检测DNMT1蛋白的表达情况，DNMT酶活性检测试剂盒检测瞬时转染对酶活性的影响。
　　4.采用脂质体法DNMT1siRNA瞬时转染人结肠癌HT-29细胞，实验分为空白对照组、阴性siRNA（15nM）组、阴性siRNA(31nM)组、DNMT1siRNA（15nM）组、、DNMT1siRNA（30nM）组，转染48小时收集细胞，转染48小时候，MTT法测定各组结肠癌细胞的增殖情况，流式检测细胞周期和凋亡情况，采用RT-PCR检测DNMT1siRNA干扰对基因CDNK1A、T-cadherin、Bcl-2和Bax的mRNA水平的影响。
　　结果:
　　1.免疫组化研究显示，T-cadherin分子的表达位于细胞膜，呈棕黄色。阅片结果显示T-cadherin在结直肠癌组织及非癌性结直肠癌组织中的阳性表达率分别为38.89％(14/36)、100％(36/36)，组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。DNMT1分子的表达位于细胞核，亦呈棕黄色。阅片结果显示在结直肠癌组织中的阳性表达率69.44％(25/36)，高于非癌性结直肠癌组织11.11％(4/36)，组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。T-cadherin蛋白表达与结直肠癌患者的年龄、性别、肿瘤大小无关，组间比较差异无统计学意义（P＞0.05，表1-1），但其与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及Dukes分期有关，且分别与肿瘤的分化程度和Dukes分期呈负相关。DNMT1蛋白表达与结直肠癌患者的年龄、性别、肿瘤大小和分化程度无关，组间差别无统计学意义(P＞0.05，表1-2)，但其与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和肿瘤分期有关，且与Dukes分期呈正相关。
　　2.结直肠癌组织DNMT1mRNA的2-△△ct均值为2.72±0.48，癌旁组织的2-△△ct均值为1.44±0.49，前者明显高于后者(P＜0.05)。结直肠癌组织的甲基化比例高达73.73％±31.24％，癌旁组织的甲基化比例为44.25％±28.01％，前者明显高于后者，(P＜0.05)。结直肠癌组织中的DNMT1mRNA表达量与T-cadherin基因启动子甲基化构成比呈正相关(rs=0.875，P=0.001)。
　　3.瞬时干扰后，Western blot结果显示DNMT1siRNA（15nM）组和DNMT1siRNA(30nM)组的DNMT1蛋白表达量明显低于空白对照组、阴性siRNA（15nM）组和阴性siRNA（30nM）组，且以DNMT1siRNA（30nM）组最低。4组中实验组的DNMT酶活性的抑制率均高于空白对照组(P＜0.05); DNMT1siRNA(15nM)组和DNMT1siRNA(30nM)组的抑制率分别高于阴性siRNA(15nM)组和阴性siRNA(30nM)组(P＜0.05)，且以DNMT1siRNA(30nM)组最高。RT-PCR结果显示DNMT1siRNA（15nM）组和DNMT1siRNA（30nM）组的DNMT1的mRNA相对表达量均低于空白对照组(P＜0.05)，且分别低于阴性siRNA（15nM）组和阴性siRNA（30nM）组(P＜0.05)，DNMT1siRNA(30nM)组更低于DNMT1siRNA(15nM)组。
　　4.WST-8法检测显示DNMT1siRNA干扰48h， DNMT1siRNA(15nM)组的结肠癌HT-29细胞存活率低于阴性siRNA(15nM)组(P＜0.05); DNMT1siRNA(30nM)组的存活率低于阴性siRNA(30nM)组(P＜0.05);DNMT1siRNA(30nM)组的存活率低于DNMT1siRNA(15nM)组(P＜0.05)。流式细胞术检测细胞凋亡率，空白对照组的细胞凋亡率最低(P＜0.05); DNMT1siRNA(15nM)组高于阴性siRNA(15nM)组(P＜0.05);DNMT1siRNA(30nM)组高于阴性siRNA(30nM)组(P＜0.05);DNMT1siRNA(30nM)组高于DNMT1siRNA(15nM)组(P＜0.05)。流式细胞仪分析DNA细胞周期，各组G0/G1期所占比例最高，各实验组均高于空白对照组，DNMT1siRNA(30nM)组和DNMT1siRNA(15nM)组(P＜0.05)明显高于各自的阴性对照组(P＜0.05);而各实验组S期细胞所占比例低于空白对照，DNMT1siRNA(15nM)组的S期细胞所占比例明显低于阴性siRNA(15nM)组(P＜0.05); DNMT1siRNA(15nM)组和DNMT1siRNA(30nM)组的G2/M期细胞比例明显低于空白组和各组的阴性对照组(P＜0.05)。RT-PCR检测Bcl-2、Bax、T-cadherin和CDNK1A mRNA表达量，干扰试验阴阳性组的Bcl-2 mRNA的相对表达量均高于空白对照组，DNMT1siRNA(30nM)组低于阴性siRNA(30nM)组;干扰试验阴阳性组的Bax mRNA的相对表达量均高于空白对照组，其中DNMT1siRNA(15nM)组和DNMT1siRNA(30nM)组高于各自的阴性对照组，且在这两组内Bax mRNA增加的比例远大于Bcl-2 mRNA增加的比例;干扰试验阴阳性组的T-cadherin mRNA的相对表达量均高于空白对照组，DNMT1siRNA(15nM)组和DNMT1siRNA(30nM)组高于各自的阴性对照组，且DNMT1siRNA(30nM)组最高;干扰试验阴阳性组的CDNK1AmRNA的相对表达量均高于空白对照组，DNMT1siRNA(15nM)组和DNMT1siRNA(30nM)组高于各自的阴性对照组，且以DNMT1siRNA(30nM)组为最高。以上比较均基于有统计学差异(P＜0.05)。
　　结论:
　　1.T-cadherin蛋白的表达在结直肠癌组织中表达相对较低，而DNMT1蛋白的表达则相对较高，且二者都与一些临床参数密切相关，这将有利于指导临床分期和评价肿瘤预后。但DNMT1蛋白有使基因甲基化的生物学功能，T-cadherin蛋白的表达过程是否会受到此影响，二者在不同组织中表达量变化的具体机制是什么，需要我们进一步研究。
　　2.结直肠癌组织中T-cadherin下调机制和启动子甲基化密切相关。DNMT1mRNA的高表达是导致T-cadherin基因启动子甲基化的重要原因，也是结直肠癌恶性转化的机制之一。
　　3.DNMT1siRNA干扰可以从mRNA水平影响DNMT1蛋白表达和DNMT酶活性，且三者改变呈一致性。
　　4.DNMT1siRNA干扰在细胞增殖和凋亡两方面均起到了抑制结肠癌细胞生长的作用;用RNA干扰抑制DNMT分子的活性，可以引起与肿瘤细胞周期和增殖、凋亡相关的调控基因mRNA的表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖，诱导凋亡，并影响细胞周期。
　　我们的研究表明:DNMT1对结直肠癌的发生、发展中有重要影响。多种结直肠癌相关基因的甲基化与DNMT1活性密切相关。通过干扰DNMT1的表达可对结肠癌HT-29细胞的增殖、凋亡和细胞周期产生显著的影响，其机制为进一步影响细胞增殖、凋亡相关调控基因如CDNK1A、T-cadherin、Bcl-2和Bax的mRNA的表达。本实验在阐明DNMT1在结直肠癌DNA甲基化中作用机制的基础上，有助于为结直肠癌的靶向治疗构建合理新靶点。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

第一部分 人结肠癌组织中DNMT1和T-cadherin蛋白表达与临床和病理的相关性研究

材料和方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

1 临床和病理情况

2 T-cadherin和DNMT1蛋白在组织中的表达

3 两种蛋白的表达分别与结直肠癌临床参数之间的关系

讨论

第二部分 人结肠癌组织中DNMT1 mRNA表达和T-cadherin甲基化检测

材料和方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

1 RT-PCR检测DNMT1 mRNA的表达

2 T-cadherin基因启动子甲基化检测

3 结直肠癌组织中DNMT1mRNA的表达与T-cadherin基因启动子甲基化之间的相关性

讨论

第三部分 DNMT1siRNA干扰对结肠癌细胞DNA甲基化的影响

材料和方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

1 蛋白免疫印迹法检测DNMT1蛋白表达

2 DNMT酶活性的检测

3 RT-PCR检测各组DNMT1 mRNA的相对表达量

讨论

第四部分 DNMT1siRNA干扰对结肠癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响

材料和方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

1 DNMT1 siRNA干扰对HT-29细胞增殖的影响

2 siRNA干扰对HT-29细胞凋亡的影响

3 siRNA干扰对HT-29细胞周期的影响

4 RT-PCR检测靶基因Bcl-2、Bax、T-cadherin和CDNK1A mRNA

讨论

参考文献

综述一 DNA甲基化与结直肠癌的研究进展

综述二 T-cadherin与肿瘤

致谢

攻读学位期间主要的研究成果