蕲艾内生菌HCH285的卷线孢菌素活性及安全性研究

摘要

本课题从蕲春蕲艾(Artemisia argyi)根茎部分离纯化得到一株内生真菌命名为HCH285，之后进行菌种鉴定、bostrycin方法学构建，同时对该HCH285内生菌代谢产物和bostrycin进行安全性和活性分析，主要结果如下:
　　1.HCH285菌种鉴定。利用微生物学与分子生物学两种方法对HCH285内生真菌进行鉴定。微生物形态学观察发现菌落呈圆形，生长初期为白色绒状毛且生长蓬松，后期逐渐成红色且菌落背面的红色产物也清晰可见。HCH285菌丝体为无色有隔菌丝。它产单个、球形或椭圆形、黑色光滑的分生孢子。此外通过分子生物学技术对其ITS序列测定确定该菌株属于黑孢霉属球黑孢霉菌（Nigrospora oryzae）。
　　2.HCH285内生菌产bostrycin分离制备方法建立。利用多种化学试剂对HCH285内生菌代谢产物提取，确定乙酸乙酯为最佳萃取试剂，以半制备液相进行化合物分离，优化卷线孢菌素bostrycin的HPLC制备方法，使用高效分析型液相检测分离纯度，其分离制备方法为:柱温∶30℃，进样体积∶700μL，流速∶3mL/min，流动相比例:甲醇∶0.3％甲酸=50∶50(v/v)，检测时间∶30min，紫外检测∶02nm;采用400MHz核磁共振波谱仪进行结构鉴定确定为卷线孢菌素bostrycin。
　　3.Bostrycin活性分析。Bostrycin抗氧化活性分析证明，对三种自由基抗性顺序由大到小为O2-＞DPPH-＞OH-。它的抗菌活性表明有较好的抗菌作用，对革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌较好。CCK-8法体外抗癌活性研究表明对U251，B10F16癌细胞的半致死浓度分别为4.30μM和6.05μM。
　　4.Bostrycin及HCH285菌代谢色素的安全性分析。引入秀丽隐杆线虫(C.elegans)为生测材料，以食品级红曲红色素为对照，研究对C.elegans各生理指标的影响。试验表明HCH285菌产色素对C.elegans的急性与慢性毒性、摄食与运动能力、生长发育状态、卵块孵化率，均没有明显抑制作用且与食品级红曲红色素作用效果一致，综合各指标显示500μg/mL内为安全剂量。以相同方法和指标，分析bostrycin对C.elegans作用，确定剂量在10μg/mL内无毒副作用。

目录

声明

摘要

1 文献综述

1．1 菊科艾属艾草研究背景

1．1．1 艾草的研究价值

1．1．2 艾草内生菌研究进展

1．2 蕲艾研究现状

1．2．1 蕲艾内生菌研究进展

1．2．2 卷线孢菌素国内外研究现状

1．2．3 秀丽隐杆线虫作为实验室生物发展史‘

1．3 本课题研究意义与内容

1．3．1 研究意义

1．3．2 选题意义

1．3．3 本研究技术路线

2 HCH285菌种鉴定与次生代谢产物提取分离

2．1 试验材料

2．1．1 HCH285菌株

2．1．2 试验仪器

2．2 试验方法

2．2．1 HCH285菌种鉴定

2．2．2 Bostrycin方法学构建

2．3 结果与分析

2．3．1 菌株鉴定

2．3．2 Bostrycin方法学构建结果

2．3．3 生长特性比较

2．4 讨论

3 Bostrycin活性研究

3．1 试验材料

3．1．1 试验试剂

3．1．2 试验仪器

3．2 试验方法

3．2．2 Bostrycin清除O2-自由基分析

3．2．3 Bostrycin清除DPPH-自由基分析

3．2．4 Bostrycin抑菌活性研究

3．2．5 Bostrycin抗癌活性研究

3．3 结果与分析

3．3．1 Bostrycin抗氧化性研究

3．3．2 Bostrycin抗菌活性研究

3．3．3 Bostrycin抗癌活性研究

3．4 讨论

4 HCH285代谢产物对秀丽隐杆线虫的安全评估

4．1 试验材料与仪器

4．1．1 试验材料

4．1．2 试验试剂

4．1．3 试验仪器

4．2 试验方法

4．2．1 OP50的培养与涂布

4．2．4 HCH285代谢物对C．elegans急性毒性研究

4．2．7 HCH285代谢物对C．elegans卵块孵化研究

4．2．8 数据统计方法

4．3．2 C．elegans保存与除菌

4．4 结果与分析

4．4．2 C．elegans生活史变化

4．4．3 C．elegans运动与摄食能力研究

4．4．4 C．elegans寿命变化研究

4．4．5 C．elegans卵块孵化影响研究

4．5 讨论

5 Bostrycin安全性研究

5．1 试验材料与仪器

5．2 试验方法

5．3 结果与分析

5．3．1 Bostrycin对卵块孵化影响

5．3．2 Bostrycin对C．elegans急性与慢性毒性影响

5．3．3 Bostrycin对C．elegans运动和摄食能力影响

5．4 讨论

6 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

6．3 本文创新点

参考文献

附录

致谢