干细胞因子及其受体在儿童再生障碍性贫血发病机制中的作用研究

摘要

研究背景与目的：再生障碍性贫血(aplasticanemia,AA,简称再障)是多种因素引起的骨髓造血功能衰竭，是严重危害儿童身体健康的常见血液病。其可能的发病机制包括：原始造血干细胞缺陷、免疫介导的造血抑制、骨髓微环境障碍。自从1904年Chauffard首次提出再障的名称后，人们便对其病因和其发病机制进行了不断的探索。许多学者应用体外造血细胞集落形成技术证明再障时骨髓各类型造血干/祖细胞均有明显的减少或缺如，患者造血功能衰竭的程度与骨髓中造血细胞的数量成正比，其CD34+细胞数和集落形成能力均明显低于正常对照组，提示造血干细胞缺乏导致造血功能衰竭可能是再障发病的主要因素。然而，应用免疫抑制剂如抗胸腺细胞或淋巴细胞球蛋白以及环孢霉素A治疗时，其疗效为50％-80％。近年来随着免疫学、细胞生物学及分子生物学的迅速发展，其中最受瞩目的是干细胞因子及其相应受体c-kit。造血微环境是造血细胞赖以生长、分化、成熟的场所，它的和谐与一些细胞因子的调控密切相关，干细胞因子(SCF)及其受体(C-kit)是作用于最早期的造血干细胞，调控着干细胞的分化及成熟。因此，推测干细胞因子及其受体可能与儿童再障的发病机制有关。但目前为止，国内外尚未见到这方面的研究报道。鉴于此，我们设计了本研究课题，共分三部分。 一、血浆可溶性SCF及c-kit受体水平与儿童再障的发病机制 1.材料和方法：本研究以再障患儿、正常足月新生儿脐血及正常儿童血浆作为实验对象，采用ELISA酶联免疫双抗体夹心法检测其可溶性SCF及可溶性c-kit受体的水平，可溶性c-kit(DIACLONE，FRANCE)批内变异系数＜6％，批间变异系数＜7.9％。检测的灵敏度为0.095ng/ml，标准曲线线性范围为0.312-10.00ng/ml，线性相关系数R=0.98；可溶性SCF(R&D公司，美国)检测灵敏度为9.0pg/ml，批内变异系数＜4％，批间变异系数＜10.3％，双对数坐标作对数线形曲线范围为31.2-2000pg/ml。操作步骤严格按照说明书进行。检测仪为英诺威生物技术有限公司的微电脑全自动酶标仪(SIGMA960，德国)，可溶性c-kit在波长为450nm处读取吸光度(OD)值，SCF在450nm和630nm读取吸光度(OD)值。以标准OD值绘制标准曲线。所有数据均用SPSS统计软件包处理，以均数±标准差(-x±s)表示。各组间比较采用方差分析，以P＜0.05示差异具有显著意义。血浆可溶性c-kit及SCF浓度与性别、年龄、病程及疾病严重程度间的关系，用相关分析方法判断。 2.结果：①可溶性SCF浓度测定结果：再障患儿SCF水平为(363.55±134.31)pg/ml，正常儿童对照组为(468.24±147.21)pg/ml，正常足月新生儿脐血血浆为(560.16±200.94)pg/ml，既正常足月新生儿脐血组＞正常儿童组＞再障儿童组。再障儿童组与正常儿童组比较，差异有显著性(p＜0.05)，再障儿童组与正常足月新生儿脐血组比较，差异有显著性(p＜0.01)，正常儿童组与正常足月新生儿脐血组比较，差异无显著性(p＞0.05)；②可溶性c-kit浓度测定结果：再障患儿组可溶性c-kit水平为(13.02±6.16)ng/ml，正常儿童对照组为(16.81±5.51)ng/ml，正常足月新生儿脐血组为(19.03±5.85)ng/ml，也既正常足月新生儿脐血组＞正常儿童组＞再障儿童组。再障儿童组与正常儿童组比较，差异有显著性(p＜0.01)，再障儿童组与正常足月新生儿脐血组比较，差异有显著性(p＜0.01)，正常儿童组与正常足月新生儿脐血组比较，差异无显著性(p＞0.05)；③血浆可溶性SCF及可溶性c-kit浓度测定结果相一致，均为正常足月新生儿脐血组＞正常儿童组＞再障儿童组。再障儿童组与正常儿童组比较，差异有显著性，再障儿童组与正常足月新生儿脐血组比较，差异有显著性，正常儿童组与正常足月新生儿脐血组比较，差异无显著性。 3.结论：①再障患儿SCF水平低于正常儿童，提示再障患儿骨髓基质细胞存在数量减少或质的缺陷，造成了SCF分泌量的下降。SCF水平降低可能在儿童再障发病机制中起一定作用；②再障患儿可溶性c-kit水平也低于正常儿童，提示可能由于再障患儿造血干/祖细胞总数量减少，导致可溶性c-kit受体生成减少所致，既再障患儿可溶性c-kit调节SCF的能力低于正常；③正常足月新生儿脐血血浆可溶性c-kit和SCF均高于再障儿童，支持正常足月新生儿脐血含有更多的造血干/祖细胞和增殖调控因子；④造血干/祖细胞增殖调控因子SCF与其相应受体的可溶形式sc-kit在再障儿童、正常儿童、正常足月新生儿脐血血浆的浓度相一致，支持可溶性c-kit是通过与SCF结合来调节或阻止SCF刺激造血细胞生长的能力。 二、造血干细胞因子SCF及其受体c-kit蛋白和mRNA表达水平与儿童再障的发病机制 1.材料和方法：收集再障患儿和正常对照儿童骨髓，同时记录其临床资料。采用密度梯度离心法分离出单个核细胞，涂片，固定，应用免疫细胞化学和核酸分子原位杂交技术，分别检测其骨髓单个核细胞(BMMNC)中SCF及c-kit受体蛋白及细胞内mRNA的表达情况，同时提取细胞总RNA，逆转录成cDNA并进行PCR扩增SCF和c-kit基因，测定再生障碍性贫血患儿与正常对照者造血干细胞因子(SCF)及其受体c-kitmRNA的表达水平。采用χ2检验进行统计分析，以α=0.05作为显著性水准。 2.结果：①再障患儿组SCF蛋白阳性表达率为22.03％，SCFmRNA阳性表达率为23.72％，RT-PCR检测SCFmRNA的阳性表达率为21.4％，正常对照组SCF蛋白阳性表达率为41.17％，SCFmRNA阳性表达率为43.13％，RT-PCR检测SCFmRNA的阳性表达率为42.4％，再障患儿组SCF蛋白及mRNA阳性表达率显著低于正常对照组，并且有统计学意义(P＜0.05)；②再障患儿SCF蛋白和mRNA的阳性表达率与患儿的性别、年龄及发病年龄等临床因素无关(均有P＞0.05)。但SCF蛋白和mRNA的阳性表达与临床分型有关，SAA组SCF蛋白和mRNA的阳性表达率明显低于CAA组SCF蛋白和mRNA的阳性表达率,二者差别具有统计学意义(P＜0.05)；③再障患儿组c-kit蛋白阳性表达率为23.72％，c-kitmRNA阳性表达率为30.50％，RT-PCR检测c-kitmRNA阳性表达率为30.4％，正常对照组c-kit蛋白阳性表达率为23.52％，c-kitmRNA阳性表达率为29.41％，RT-PCR检测c-kitmRNA阳性表达率为39.4％，正常对照组虽然较再障患儿组略有升高，但无显著性差异(P＞0.05)；④未发现再障患儿c-kit蛋白和mRNA的表达与患儿的性别、年龄、发病年龄、临床分型等临床因素有关(均有P＞0.05)。 3.结论：①再生障碍性贫血患儿造血干细胞因子SCF蛋白和mRNA的表达水平均较正常对照有显著性降低，且用免疫细胞化学和核酸分子原位杂交、RT-PCR三种方法检测结果一致，确实说明再生障碍性贫血患儿存在SCF表达的异常，且是发生在转录水平的异常，进一步提示SCF降低在儿童再障发病机制中起一定作用，再障儿童存在SCF/C-kit信号转导途径的异常；②再障患儿c-kit受体蛋白和mRNA的表达水平较正常对照无显著性差异，提示c-kit受体蛋白和mRNA的表达与儿童再生障碍性贫血的发病似乎无关，但其结构是否有突变及功能是否有异常有待进一步研究；③SAA组与CAA组SCF蛋白和mRNA的阳性表达率与正常对照组比较均明显降低，但SAA组降低更明显，进一步证实了SAA与CAA为同一质疾病，且SAA较CAA临床症状更严重；④SCF在儿童再生障碍性贫血中具有良好的临床治疗应用前景。 三、c-kit受体基因与儿童再障发病机制的研究 1.材料与方法：收取再障患儿和正常对照儿童骨髓或外周血，采用密度梯度离心法分离出单个核细胞，提取细胞总RNA，根据c-kit基因结构特点，设计出其外显子9、11、13三对引物，并进行RT-PCR扩增，将扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，阳性表达的标本再行聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后扫描照相，分别采用凝胶图象分析、SSCP技术及基因序列分析手段，比较再障患儿和正常儿童c-kit基因外显子结构有无差异，为进一步探讨儿童再障的发病机制提供有价值的实验依据。 2.结果：①c-kit基因外显子9、11、13分别进行基因扩增后琼脂糖凝胶电泳分析，再障儿童及正常对照儿童基因表达二者间无统计学意义(P＞0.05)，阳性标本行聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染后未见基因的泳动异位及单链带数目的增多和减少；②行基因测序后，结果显示再障患儿C-Kit基因exon9、11、13的碱基序列与正常儿童相比无差异，与genebank中的基因图谱进行比对[22]，exon9、11、13均未见碱基序列改变或碱基数目的增多、缺失等情况存在。 3.结论：再障患儿c-kit基因外显子9、11、13无突变，基因测序后未发现基因结构及序列的异常。提示儿童再障的发病机制可能不是由c-kit基因结构改变引起。 以上结论表明：再生障碍性贫血儿童骨髓造血衰竭和全血细胞减少可能与患儿血浆中可溶性SCF和c-kit以及骨髓单个核细胞中的造血干细胞因子SCF蛋白和mRNA基因表达减少有关，而与c-kit受体表达和受体基因结构的改变无关。

目录

论文说明：英文缩略词索引

摘要

第一部分:血浆可溶性SCF及c-Kit水平与儿童再障的发病机制

第二部分干细胞因子及其受体蛋白和mRNA与儿童再障的发病机制

第三部分c-Kit受体基因与儿童再障的发病机制

总结

综 述:干细胞因子及其受体与造血调控

附录:博士在读期间发表的文章

致谢