GSK3在吸烟致气道上皮和肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤修复中的作用研究

摘要

第一部分 糖原合成酶激酶3在吸烟诱导的猪气道上皮细胞鳞状分化中的作用研究 气道(气管和支气管)上皮的鳞状细胞化生常见于慢性支气管炎症、致癌剂刺激(如吸烟)等，一般被认为是对慢性损伤的一种适应性反应，也是肺鳞癌的癌前病变，其分子机制尚未完全阐明。糖原合成酶激酶3(glycogensynthasekinase3，GSK3)是一种多功能的蛋白激酶，有结构和功能相似的两种亚型GSK3α和GSK3β，在静息细胞内呈组成性激活，其N末端丝氨酸残基(Ser21-GSK3α，Ser9-GSK3β)的磷酸化可导致其活性抑制[1]。多年来大量的研究表明，GSK3具有广泛的底物，包括代谢酶、翻译起始因子、转录因子、细胞周期相关蛋白、癌基因产物和细胞骨架蛋白等，可参与糖代谢、蛋白质合成以及细胞的增殖、分化、凋亡和运动等多种生命活动。近来研究显示GSK3及其转录因子底物AP-1(activatorprotein-1)可能参与气道上皮鳞状分化的发生。因此，本研究对GSK3的表达、GSK3和AP-1信号在吸烟诱导的气道上皮细胞鳞状分化中的作用进行了初步探讨。 转录因子活性检测显示香烟烟雾提取物和尼古丁处理可显著增强转录因子AP-1与外皮蛋白基因上游调节区域的结合活性；而用GSK3的抑制剂LiCl和SB216763模拟香烟成分的作用也得到了类似的结果，提示GSK3可能通过负向调节AP-1的活性从而介导了香烟成分诱导的猪气道上皮鳞状分化。 小结 上述结果表明：(1)香烟成分可抑制猪气道上皮细胞的增殖并诱导其发生鳞状分化。(2)GSK3在气道上皮细胞中有丰富的表达，可能通过负向调节AP-1的活性从而介导了香烟成分诱导的猪气道上皮鳞状分化。 第二部分 吸烟致肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤中GSK3β的活性变化对β-catenin/TCF信号途径的影响 大量研究证明，吸烟能够从多个方面损伤肺泡上皮细胞，阻碍其迁移、增生和分化以修复受损区域，因而有助于吸烟相关疾病(如慢性阻塞性肺疾病和支气管源性肺癌等)的发生与发展。然而，吸烟致肺泡上皮细胞损伤的分子机制还远未阐明。 β-连环素(β-catenin)是一种多功能蛋白，既可作为细胞骨架蛋白与E-钙粘附素结合，参与组成中间连接，维持上皮细胞的极性和组织结构的完整性；又是Wnt信号途径的重要成员，可与TCF/LEF(Tcellfactor/lymphoidenhancerfactor)结合形成转录因子复合体，调节多种基因的表达，参与细胞和组织的发育分化、损伤修复以及肿瘤的发生发展等生物学过程。最近研究显示，尼古丁和香烟致癌物NNK可促进糖原合成酶激酶3(glycogensynthasekinase3，GSK3)的抑制性磷酸化，而GSK3β可磷酸化调节β-catenin，在经典的Wnt信号途径中起关键性抑制作用。 为进一步分析GSK3β是否在其中发挥了作用，用持续激活突变型GSK3β(GSK3βS9A，不受GSK3的上游激酶下调而持续激活)转染细胞后检测GSK3β和β-catenin的水平，结果显示GSK3β的表达明显增强，而β-catenin的表达则显著降低，证实了肺泡Ⅱ型上皮细胞中GSK3β的表达和活性增强可促进β-catenin的降解；与此同时，也证明所用质粒GSK3βS9A是可靠的。然后，将GSK3βS9A与pGL3-OT共转染后，再加入CSE处理，进行荧光报告基因分析。分析发现，与仅用CSE处理组相比，共转染GSK3βS9A组的荧光素酶活性显著降低，差异有极显著意义(P＜0.01)，说明细胞转染GSK3βS9A后表达的突变型GSK3β不受CSE的抑制而持续激活，促进了β-catenin的降解，因而导致β-catenin/TCF信号的抑制。上述结果表明，在肺泡Ⅱ型上皮细胞中，CSE可通过抑制GSK3β而增强β-catenin/TCF的转录活性。 小结 本实验表明：(1)CSE可抑制肺泡Ⅱ型上皮细胞中GSK3β的表达和活性。(2)CSE可促进肺泡Ⅱ型上皮细胞中β-catenin的表达和转位从而激活β-catenin/TCF信号。(3)在肺泡Ⅱ型上皮细胞中，CSE可通过抑制GSK3β而增强β-catenin/TCF的转录活性。 本实验提示：GSK3β可通过对β-catenin/TCF信号途径的调节，参与吸烟致肺泡上皮细胞的损伤，进而可能介导吸烟相关疾病的发生与发展。

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第一部分糖原合成酶激酶3在吸烟诱导的猪气道上皮细胞鳞状分化中的作用研究

第二部分吸烟致肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤中GSK3β的活性变化对β-catenin/TCF信号途径的影响

糖原合成酶激酶3β与信号途径

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