高表达蛋白Mst1对人胚肾HEK293细胞凋亡和增殖的影响

摘要

第一部分：四环素诱导性高表达Mst1的人胚肾293细胞株的建立 目的：建立受四环素诱导表达外源基因Mst1的真核表达体系人胚肾293(HEK293)细胞株，用于进一步基因功能的研究。 方法：利用T-Rex(Tetracycline - Regulated Expression)系统建立四环素可调控的表达体系。首先，构建含有目的基因Mst1的质粒pcDNA4/TO-Mst1。其次，将调节性pcDNA6/TR质粒用脂质体介导法转染人胚肾293细胞,经药物Blasticidin S筛选后的克隆用有限稀释法进行单克隆化。单克隆扩增后再瞬时转染质粒pcDNA4/TO-Mst1并用Zeocin筛选并挑选单克隆。然后经四环素诱导表达，通过Western Blot方法检测目的基因Mst1的表达水平，从而筛选出由四环素诱导的高表达外源基因Mst1的人胚肾293单克隆细胞株。 结果：通过T-Rex系统成功构建由四环素调控的高表达外源基因Mst1的人胚肾293细胞株。 结论：四环素诱导表达目的基因Mst1的人胚肾293细胞株可用于外源基因的真核调控表达,为研究目的基因Mst1及其它真核基因功能提供了一种有力的实验手段。 第二部分：四环素诱导性高表达蛋白Mst1对人胚肾HEK293细胞的增殖与凋亡的影响 目的：探讨四环素诱导性表达外源性Mst1（Mammalian sterile 20-like kinase 1）对HEK 293细胞增殖与凋亡的影响。 方法：在已经成功构建的四环素可诱导表达Mst1的HEK 293细胞系中，加入四环素诱导Mst1在HEK293细胞中高表达。通过蛋白Western Blot分析Mst1在HEK 293细胞中的表达情况；分别在加入四环素后12，24，36，48小时通过四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT）观察高表达Mst1后对细胞增殖的影响；加入四环素后36小时加入BrdU，通过其掺入比率来显示Mst1对细胞增殖的影响；加入四环素后后36小时，加入顺铂作用14小时后通过Annexin V检测其对细胞凋亡的影响。 结果：四环素成功诱导Mst1高表达；MTT及BrdU结果显示在HEK 293细胞中高表达Mst1后细胞增殖明显受到抑制；Annexin V检测结果提示高表达Mst1后，细胞的凋亡率相对增高。 结论：在HEK 293细胞中高表达Mst1，不仅可以抑制细胞增殖，还可促进细胞凋亡。