高糖诱导Bim蛋白高表达而促肾近曲小管上皮细胞凋亡的机制探讨

摘要

目的：
　　拟以人肾近曲小管上皮细胞(human proximal tubular epithelialcells，HK-2细胞)为对象，研究高糖环境下Bim与HK-2细胞凋亡的关系，并在此基础上，进一步研究自噬在其中所起的作用。
　　方法：
　　1.第一步
　　用不同糖浓度处理HK-2细胞，检测其中Bim蛋白的表达情况，及细胞凋亡和自噬的情况。
　　1.1.细胞分组及培养
　　将HK-2细胞系分为两组:NG组即正常糖对照组（5.5mmol/L D-无水葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇）和HG组即高糖试验组（30.0mmol/L D-无水葡萄糖）。在1640培养基、37℃及含5％CO2条件下常规培养，拟设0h、24h、48h这三个检测时间点。
　　1.2.检测Bim mRNA及蛋白表达
　　利用RT-PCR法检测Bim mRNA表达、Western Blot法检测Bim蛋白表达。
　　1.3.检测细胞凋亡的情况
　　利用TUNEL法检测细胞凋亡的比例;利用Western Blot法检测active-caspase3蛋白表达，以间接反映细胞凋亡的情况。
　　1.4.检测细胞自噬的情况
　　利用Western Blot法检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值，反映细胞自噬的情况。
　　2.第二步
　　用转染Bim siRNA的方式下调Bim蛋白表达，用转染过表达质粒的方式上调Bim蛋白表达，在此基础上分析HK-2细胞凋亡、自噬的情况。
　　2.1.细胞培养及分组
　　NG组和HG组的HK-2细胞分别分为以下四组:siNC组（转染无意义siRNA）、sibim组（转染Bim siRNA）、sibim+质粒组（转染Bim siRNA和siRNA-resistant质粒）、质粒组（转染Bim过表达质粒）。
　　2.2.检测Bim蛋白表达
　　利用Western Blot法检测Bim蛋白表达。
　　2.3.检测细胞凋亡的情况
　　利用TUNEL法检测细胞凋亡比例;利用Western Blot法检测active-caspase3蛋白表达，间接反映细胞凋亡的情况。
　　2.4.检测细胞自噬的情况
　　利用Western Blot法检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值，反映细胞自噬的情况。
　　3.第三步
　　在用Bim siRNA抑制Bim蛋白表达的前提下，下调自噬活性，分析HK-2细胞凋亡的情况。
　　3.1.细胞培养及分组
　　将HG组中的sibim亚组HK-2细胞分为两组:对照组即DMSO组(只加入3-MA的溶媒DMSO)和试验组即3-MA组（加入3-MA）。
　　3.2.检测细胞凋亡的情况
　　利用TUNEL法检测细胞凋亡比例;利用Western Blot法检测active-caspase3蛋白表达，间接反映细胞凋亡的情况。
　　4.统计学处理采用SPSS18.0统计软件处理数据。两组数据的比较应用学生t检验(student's t test)。多组间的比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA)。数据采用mean±SEM表示，检验标准α=0.05，P＜0.05时认为有统计学意义。
　　结果：
　　1.高浓度葡萄糖组HK-2细胞凋亡和Bim蛋白表达增加对照组HK-2细胞不管是24小时还是48小时，其TUNEL染色阳性的细胞均微乎其微;而高糖组，其TUNEL染色阳性的细胞比例比对照组明显增多，而且随高糖培养时间的延长，凋亡细胞增多的趋势越来越明显。应用单因素方差分析的方法(One-way ANOVA)进行统计学分析，可以发现高糖组24小时的细胞凋亡率与对照组同时间的细胞凋亡率比较或是与同浓度0时的细胞凋亡率比较，均有显著性差异，其P值均＜0.05;而高糖组48小时的细胞凋亡率与对照组同时间的细胞凋亡率比较或是与同浓度0时的细胞凋亡率比较，也有显著性差异，其P值分别＜0.05和＜0.01。用western blot方法检测active-Caspase3蛋白的表达量也可以发现相同的规律。
　　高糖培养组HK-2细胞随着时间的延长，其BimEL蛋白的表达逐渐升高;而对照组24小时、48小时均未见BimEL蛋白的表达的增加。Bim蛋白的另一种主要异构体BimL的表达量也随着高糖培养的时间逐渐增加。用单因素方差分析处理数据统显示:高糖培养24小时HK-2细胞BimEL蛋白的表达较同等培养时间的对照组显著增加(P＜0.05)，较高糖刺激前显著增加(P＜0.05);HK-2细胞经高糖培养48小时其BimEL蛋白的表达较同等培养时间的对照组显著增加(P＜0.01)，较高糖培养前显著增加(P＜0.01)。
　　高糖培养下HK-2细胞Bim mRNA的水平明显增加。高糖培养24小时Bim mRNA相对水平较高糖培养前和相同时间点的对照组均显著增加（P值均＜0.01），高糖培养48小时Bim mRNA相对水平也较高糖培养前和相同时间点的对照组显著增加（P值均＜0.01）。
　　用western blot法检测LC3蛋白的两种形式LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ及其比值（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）。发现不管是高糖组还是对照组，培养24小时还是48小时，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均较低，也就是说细胞的自噬始终处于一个较低的水平，高糖组的自噬较对照组并没有见到明显的改变。
　　2.Bim蛋白对HK-2细胞凋亡和自噬的影响
　　和无意义siRNA组（siNC组）组对比，有效的siRNA的转染(siBim组)将内源性Bim蛋白抑制到了原有水平的21％。在同样高糖培养48小时的条件下，下调Bim组（siRNA组）的HK-2细胞的凋亡比例没有增加;而siNC组细胞凋亡的比例明显增加。我们应用了siRNA-resistant Bim(Bim-res)质粒与siRNA共转染来排除脱靶现象。siBim组高糖培养后下降的凋亡细胞的比例，在给予Bim-res质粒后又恢复了，siBim加Bim-res组比siBim组凋亡细胞的比例显著增加(P＜0.05)。
　　我们将正常糖对照的HK-2细胞分成两个小组，一组正常培养（对照组），一组转染BimEL蛋白过表达质粒，培养48小时后，用TUNEL法检测细胞凋亡情况，发现过表达质粒组细胞较对照组凋亡细胞的比例明显增加。
　　我们在正常葡糖浓度培养的HK-2细胞中用siRNA下调Bim，培养48小时，可见LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显升高，由1.0上升到了2.0，而用拮抗siRNA的Bim-res质粒与siRNA共转染后，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值又下降到了1.1。在30mmol/L葡萄糖组，用siRNA下调HK-2细胞Bim，培养48小时，可见0时、24小时、48小时LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值分别是:1.0、2.2、3.0，意味着下调Bim后，随着时间的延长，细胞的自噬程度逐渐增强;而将Bim-res质粒与siRNA共转染后，0时、48小时LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值分别是:1.0、1.3，表明去除下调Bim的因素后，48小时的高糖培养，细胞自噬程度并没有明显的改变。
　　3.抑制自噬增加了HK-2细胞的凋亡
　　我们将转染了针对于Bim的siRNA的HK-2细胞，培养2天后，再给予高糖（30mmol/L葡萄糖）培养，然后分成两组:试验组（3-MA组）加用自噬抑制剂3-MA;对照组（DMSO组）只给予3-MA的溶媒二甲基亚砜(DMSO)。我们可以看到，试验组与对照组相比，不管是24小时还是48小时，细胞凋亡比例均明显增加（用TUNEL法检测）;Western Blot法检测active-caspase3表达也可以发现同样的规律。
　　结论：
　　1.我们的研究首次通过体外细胞实验发现高浓度葡萄糖可以引起肾近曲小管上皮细胞凋亡增加，而且随着高糖培养的时间的延长，细胞凋亡逐渐增多。
　　2.高糖通过上调Bim蛋白的表达，从而促进肾近曲小管细胞凋亡的，而Bim蛋白上调伴随着基因转录水平的上调。
　　3.细胞基础状态下的自噬水平较低。高糖诱导Bim蛋白表达增加从而引起肾小管上皮细胞凋亡增加的机制与细胞自噬程度的改变关系不大，有可能是Bim通过Bax/Bak介导线粒体途径的细胞凋亡。
　　4.通过下调Bim，HK-2细胞能够恢复被Bim抑制的自噬，从而发挥自噬对细胞的保护作用。也就是说，下调Bim蛋白的表达，除了直接影响凋亡途径外，还能增加细胞自噬，从而抑制细胞凋亡。
　　5.抑制自噬本身可以增加细胞凋亡，此时Bim已被siRNA下调，所以这个过程是不依赖于Bim蛋白的。
　　主要创新点：
　　1.我们的研究首次证明了高浓度葡萄糖可以通过上调Bim蛋白表达从而引起肾小管上皮细胞凋亡增加，并且随着高糖培养时间的延长，细胞凋亡的比例逐渐增加。
　　2.用SiRNA下调Bim蛋白表达可以恢复被Bim抑制的细胞自噬活性，并具有减少细胞凋亡的保护性作用。
　　3.自噬抑制剂3-MA在已经下调了Bim的HK-2细胞中重新触发了细胞凋亡，说明抑制自噬本身可以促进细胞凋亡，而这一过程是不依赖于Bim蛋白的。

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结论

主要创新点

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