HBx联合AFB1诱导肝卵圆细胞体内转化为肝癌的实验研究

摘要

本研究分为二部分：
　　 第一部分：转HBx基因大鼠卵圆细胞株的建立及鉴定
　　 第一节、真核表达质粒pEGF-HBx构建和鉴定
　　 目的:构建带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达质粒pEGF-HBx，以利于转染细胞的标记和观察，为进一步研究HBx基因在卵圆细胞中的生物学作用奠定基础。
　　 方法:用PCR方法从质粒pcDNA3.1-HBx中扩增含KpnⅠ和Hind Ⅲ限制性酶切位点的HBx基因序列。对增强型绿色荧光蛋白质粒载体pEGFP-N1及扩增的HBx目的基因片段进行双酶切，纯化后用连接酶连接得到重组质粒pEGFP-HBx，将其转化大肠杆菌DH5α、涂皿于培养板，卡那霉素筛选培养得到阳性菌落，扩增培养后提取质粒，用双酶切和基因测序鉴定分析质粒是否构建成功。
　　 结果:双酶切后电泳，显示构建的pEGFP-HBx质粒中含有完整HBx基因大小（465kb）的片段，基因测序显示插入的目的基因连接位点和阅读框架正确，插入序列为完整的HBx基因，说明质粒构建成功。
　　 结论:成功构建带荧光的真核表达质粒pEGFP-HBx，为转染肝卵圆细胞和进一步研究HBx基因在卵圆细胞中的作用奠定了坚实基础。
　　 第二节、转HBx基因大鼠卵圆细胞株的建立及鉴定
　　 目的:建立稳定、高效表达HBx基因的大鼠肝卵圆细胞株，以便进一步研究HBx基因和卵圆细胞在肝癌发生过程中的作用和机制。
　　 方法:通过脂质体介导法将前面构建的真核表达质粒pEGFP-HBx转染大鼠卵圆细胞 (LE/6)，经G418筛选，传代培养后得到稳定表达EGFP-HBx融合蛋白的抗性克隆。分别采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫细胞化学（ICC）技术检测抗性克隆中HBx基因的转录和翻译。
　　 结果:经过一个月左右的筛选培养，获得了稳定表达绿色荧光蛋白的卵圆细胞株；细胞克隆传代培养20代后仍表达强的荧光。RT-PCR及免疫细胞化学检测均发现HBx基因在抗性细胞中得到了稳定转录和翻译。
　　 结论:pEGFP-HBx质粒能成功地转染卵圆细胞，并在细胞中得到有效复制、转录和翻译。实验获得了稳定、高效表达EGFP-HBx融合蛋白的大鼠卵圆细胞株，为进一步研究转HBx基因卵圆细胞在肝癌发生过程中的作用和机制奠定了基础。
　　 第二部分：HBx联合AFB1诱导卵圆细胞动物体内转化为肝癌的实验研究
　　 第一节、HBx联合AFB1诱导肝卵圆细胞裸鼠体内转化为肝癌的研究
　　 目的:（AFB1）是否能诱导肝卵圆细胞异常转化为肝癌，为明确肝癌是否起源于肝卵圆细胞找到直接证据。
　　 方法:在使用AFB1作为诱癌剂的情况下，分别将转染pEGFP-HBx、pEGFP-N1质粒的大鼠肝卵圆细胞种植于裸鼠肝实质内和皮下，观察种植细胞成瘤情况及性质。实验分为五组：A组：24只，肝内和皮下均种植转HBx基因的卵圆细胞，同时喂食AFB1；B组：20只，肝内和皮下种植转HBx基因的卵圆细胞，不喂食AFB1；C组：20只，肝内和皮下均种植转pEGFP卵圆细胞，同时喂食AFB1；D组：20只，肝内和皮下种植转pEGFP卵圆细胞组，不喂食AFB1；E组：15只，肝内和皮下均不注射细胞，单纯喂食AFB1。用透射电子显微镜和HE染色进行检查；并用免疫组织化学检测肿瘤中HBx、OV6、HepParl、CK8、CK7、PCK、Vimentin、SMA、AFP、C-myc和TGF-α的表达情况，明确其性质。
　　 结果：16周时，各组皮下成瘤情况为：A组（10/24例）、B组（8/20例）、C组（10/20例）、D组（9/20例）和E组（0/15例）；肝内成瘤情况：只有A组（4/24例）在肝内形成肿瘤，其于各组均为0。皮下肿瘤由间质细胞组成，表达OV6、Vimentin和SMA；两种细胞（p-HBx和pEGFP）形成的皮下肿瘤性质相似；透射电镜检查证实皮下肿瘤为不同程度分化的间质瘤。肝内肿瘤由间质性细胞和少数异型性上皮样细胞（癌细胞）组成，后者表达HBx、OV6、HepPar1、CK7、CK8、PCK、AFP、C-myc和TGF-α抗原；透射电镜检查发现这些异型性上皮样细胞为癌细胞。因而说明肝内肿瘤为恶性间质细胞瘤和肝细胞癌组成的混合体（肝癌肉瘤）。
　　 结论：卵圆细胞可在皮下形成间质肿瘤，只有HBx基因和AFB1共同作用才能使肝卵圆细胞在肝内异常转化成肝癌，证明肝癌很可能直接起源于卵圆细胞的异常转化。
　　 第二节、EMT和MET在肝卵圆细胞转化成肝癌过程中的作用
　　 目的：研究肝卵圆细胞体内转化成肝癌的机制，探讨上皮细胞-间质转变(EMT)和间质细胞-上皮转变(MET)在这一转化过程中的作用。
　　 方法：在使用AFB1作为诱癌剂的情况下，将转染HBx基因的大鼠肝卵圆细胞种植于裸鼠皮下，形成皮下肿瘤后再将其移植至肝实质内，使其继续生长，观察成瘤情况和组织学差异。分组为：A组 24只，皮下种植转染pEGFP-HBx质粒卵圆细胞；B组 20只，皮下种植转pEGFP-N1质粒的卵圆细胞。10周后，选择A组皮下肿瘤10例和B组皮下肿瘤8例，移植至同一裸鼠肝实质内使其继续生长，分组为：C组 10只，肝内种植A组（来源于转染HBx细胞）形成的皮下瘤；D组 8只，肝内种植B组（来源于未转染HBx细胞）形成的皮下瘤。继续喂食AFB1，观察8周。收集皮下肿瘤和肝内肿瘤，进行HE和透射电镜检查，明确肿瘤性质；同时免疫组织化学染色检测皮下肿瘤和肝内肿瘤中EMT相关标志物CK8、PCK、Vimentin、SMA、E-cadherin和β-catenin的表达差异。
　　 结果：卵圆细胞种植于皮下后形成完全由间质细胞组成的间质瘤（A和B组），其强阳性表达Vimentin和SMA，但无E-cadherin和CK表达，表明其发生了EMT。皮下肿瘤移植至肝实质后，可继续生长：来源于转HBx细胞的肝内肿瘤（C组）由占大多数的间质瘤细胞和少数肝癌细胞混杂而成，为肝内癌肉瘤，癌细胞表达HBx、HepPar1、CK8、PCK、E-cadherin和β-catenin抗原，而间质瘤细胞中Vimentin和SMA表达下降，表明发生了MET；而未转HBx细胞形成的肝内肿瘤（D组）仍为间质肿瘤，未发生MET。
　　 结论：不同的局部微环境对卵圆细胞的分化方向起重要作用，在HBx转染和AFB1的共同作用下，肝卵圆细胞可异常转化成肝癌，其转化机制与EMT和MET有关，而且HBx转染很可能促进MET的发生。