负载HBx抗原的DC疫苗在人免疫重建荷人肝癌裸鼠模型体内诱导的特异性抗肝癌效应的实验研究

摘要

目的:
　　制备由HBx抗原负载的DC疫苗,检测其在人免疫重建荷人肝癌裸鼠模型体内的抗肿瘤作用,为肝癌的生物免疫治疗提供新的改良方式和科学依据。
　　方法:
　　1.稳定转染HBx蛋白HepG2人肝癌细胞系的鉴定及培养:利用RT-PCR和Western blot法检测稳定转染HBx蛋白的HepG2人肝癌细胞系中HBx蛋白的表达;确定稳定转染细胞株的G418筛选浓度。
　　2.人免疫重建裸鼠模型的建立及鉴定:将无免疫渗漏的12只裸鼠随机分为2组:腹腔注射人外周血单个核淋巴细胞6只作为人免疫重建组,腹腔注射无菌PBS6只作为空白对照组。观察小鼠生物学特征;ELISA检测小鼠外周血人IgG含量;HE染色法检测小鼠肝脾组织中淋巴细胞的浸润情况。
　　3.HBx抗原负载的DC疫苗在人免疫重建荷人肝癌模型体内的抗肿瘤作用观察:在体外培养人外周血单个核细胞,利用细胞因子(GM-CSF、IL-4和TNF-α)诱导分化出DC细胞,将HBx抗原负载制备DC疫苗,在15只人免疫重建24h后的裸鼠的右前腋下接种稳定转染HBx蛋白HepG2人肝癌细胞,建立人免疫重建荷人肝癌裸鼠模型;裸鼠皮下移植瘤种植后的第7天将其随机分为3组进行治疗:HBx-DC组,5只,每只腹腔注射HBx抗原致敏的DC疫苗2x105/0.2ml;DC组,5只,每只腹腔注射DC2x105/0.2ml;对照组,5只,每只腹腔注射生理盐水0.2ml。观察小鼠的一般情况及肿瘤组织的生长情况;ELISA法检测小鼠血清中TH1、TH2类细胞因子表达;PI染色法检测肿瘤组织细胞周期改变,计算肿瘤细胞增殖指数;病理学观察肿瘤组织病理情况;免疫组织化学检测相关因子P53、Bax、Casepas-3、Bcl-2、VEGF、CD34、MMP-2、CDK2、MMP-9、、P21表达情况。
　　结果:
　　1.RT-PCR检测细胞系中HBx示:稳定转染HBx组,HBx mRNA的表达量明显高于空白对照组及空载体组,且差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot细胞系中HBx蛋白表达水平示:分别瞬时转染不同剂量的HBx蛋白的HepG2细胞,其HBx蛋白表达水平均低于稳定转染HBx组,且差异具有统计学意义(P<0.05)。观察2周后发现,600μg/ml即能使细胞漂浮死亡,即该细胞系筛选浓度。
　　2.12只人免疫重建裸鼠在9周内无死亡,未观察到移植物抗宿主反应出现。分别于注射后的第2、4、6、8周,使用ELISA法检测Balb/c裸鼠外周血中人IgG含量发现,人免疫重建组小鼠外周血人lgG含量随着时间的推移逐渐升高,且各时间点间人lgG含量差异具有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,人免疫重建组在相同时间点人lgG含量均明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。HE染色检测小鼠肝脾组织发现:人免疫重建组裸鼠脾脏组织中淋巴细胞浸润,人免疫重建组裸鼠肝脏组织以及对照组裸鼠肝、脾组织,均未见淋巴细胞浸润。
　　3.HBx-DC组、DC组小鼠精神状态较好,对照组小鼠精神萎靡,局部肿瘤组织出现溃破。HBx-DC组小鼠的皮下移植瘤增长速度明显减慢,差异在一周后具有统计学意义(P<0.05)。第六周将裸鼠处死取肿瘤组织称重,发现HBx-DC组瘤重明显低于其他两组,差异具有统计学意义(P<0.05),瘤种抑瘤率为0.6。治疗的第5周,ELISA法检测发现:与其他两组比较,HBx-DC组Th1类细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α明显上升,Th2类细胞因子IL-4、IL-6、IL-10明显下降,差异均具有统计学意义(P<0.05)。HBx-DC组肿瘤细胞增殖指数显著低于其他两组(P<0.05)。病理学证实肿瘤为有HBx表达的人肝癌,且HBx-DC组肿瘤组织内肿瘤细胞出血、坏死,有大量的淋巴细胞浸润。免疫组化发现HBx-DC组P53、Bax、Casepas-3、P21的表达显著上调(P<0.05),Bcl-2、VEGF、CD34、MMP-2、MMP-9的表达显著下调(P<0.05)。
　　结论:
　　1.HBx蛋白的稳定表达对HepG2细胞的生物学行为产生了影响。
　　2.裸鼠腹腔注射人外周血淋巴细胞,能够成功地建立人免疫重建裸鼠模型,更好的模拟人体免疫环境,为免疫治疗研究提供动物模型。
　　3.负载HBx抗原的DC疫苗在人免疫重建荷人肝癌裸鼠模型体内可以明显减慢肿瘤生长速度、调节机体免疫平衡、抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞坏死,发挥抗肿瘤免疫作用。

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前言

第一部分：稳定转染HBx蛋白的HepG2肝癌细胞系的鉴定及培养

材料和方法

1.实验材料

2.实验方法

3.统计学分析

实验结果

1. 稳定转染HBx蛋白的HepG2肝癌细胞系的鉴定

2 确定细胞筛选浓度及培养

第二部分 人免疫重建荷人肝癌裸鼠模型的建立

材料和方法

1. 实验材料

2.实验方法

3.统计学分析

实验结果

1.ELISA法筛查BALB/c裸鼠免疫渗漏情况

2.小鼠一般生物学特征观察

3. 裸鼠外周血人lgG含量

4.小鼠肝脾组织病理学改变

第三部分：HBx蛋白抗原负载DC对人免疫重建荷人肝癌BALB/c裸鼠的抗肿瘤作用

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

3 统计学分析

实验结果

1 小鼠一般情况

2、小鼠移植瘤生长情况（检测肿瘤体积、称瘤重，绘制肿瘤生存曲线，计算瘤重抑瘤率）

3.治疗后小鼠血清中人Th1、Th2类细胞因子分泌的检测

4 裸鼠瘤体组织细胞周期

5. 肿瘤组织病理学观察

讨论

结论

参考文献

综述

攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文

本论文受以下课题资助

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