非Smad通路在小鼠结肠癌肝转移中的作用

摘要

第一部分CT26-Smad4KD细胞系的建立及鉴定
　　目的:建立CT26-Smad4KD稳定细胞系并对其进行鉴定。方法:选用小鼠结肠癌细胞系CT26作为研究对象。以已被文献验证的有效shRNA序列为干扰序列并使用通用阴性对照序列,分别构建vshRNA载体。转染293T细胞包被慢病毒颗粒。在野生型CT26细胞系中,采用慢病毒感染的方式建立Smad4干扰组以及相应的空载体对照组。使用puromycin筛选获得阳性细胞克隆。以westernblot和Co-immunoprecipitation检测上述细胞克隆中Smad4蛋白的表达情况及Smad2/3/4复合物的形成情况。并对非Smad通路中MAPK通路进行初步检测。结果:在含polybrene5μg/ml的RPMI-1640培养基做溶媒,MOI=50时,慢病毒在CT26细胞感染效率最高。经westernblot检测,野生型CT26细胞和阴性对照克隆均正常表达Smad4,干扰组中,Smad4KD＃1、Smad4KD＃8和Smad4KD＃18克隆的Smad4表达下降明显,干扰效果好。经Co-immunoprecipitation检测,无论是否给予外源性TGF-β,CT26-Smad4KD细胞系均不能形成正常水平的Smad2/3/4复合物。结论:成功建立CT26-Smad4KD细胞系及其阴性对照。
　　第二部分:干扰Smad4抑制CT26细胞的增殖，促进其凋亡
　　目的:探讨Smad4蛋白在小鼠结肠癌细胞增殖中的作用。方法:选用小鼠结肠癌细胞系CT26、其阴性对照NC及敲减Smad4的细胞系CT26-Smad4KD作为研究对象。通过CCK-8实验,观察及比较野生型CT26细胞、阴性对照组及Smad4KD细胞的生存曲线,以及在给予外源性TGF-β条件下,其细胞增殖能力。然后,通过软琼脂糖克隆形成实验,检测野生型CT26细胞在敲减Smad4蛋白后,其在半固态悬浮环境中的非锚定增殖能力。接下来,我们使用AnnexinV-FITC/PI双染细胞凋亡实验在流式细胞仪上比较野生型CT26细胞干扰Smad4蛋白前后,在细胞凋亡的改变。最后,我们在Balb/c-nu鼠进行了体内实验。我们将野生型CT26与Smad4KD细胞分别注射到Balb/c-nu鼠皮下,观察其体内成瘤能力。结果:CCK-8实验结果表明,在未给予外源性TGF-β条件下,干扰Smad4后,CT26细胞的增殖能力在第48h开始,较野生组和阴性对照组有明显降低;而阴性对照组与野生型则呜显著差异。干扰Smad4后,CT26细胞的增殖能力下降了约25％,而阴性对照NC组无明显变化。而给予外源性TGF-β刺激时,野生型CT26、阴性对照NC组及Smad4KD三组细胞之间增殖无显著性差异。Smad4蛋白在小鼠结肠癌细胞CT26的增殖中起促进作用,并且干扰Smad4蛋白之后,细胞对外源性TGF-β的生长抑制效应失去应答。然后,软琼脂克隆形成实验结果表明,敲减Smad4的小鼠结肠癌细胞CT26的克隆形成明显比野生型及阴性对照组的细胞少,而且所形成的克隆直径也小于野生型和阴性对照组。AnnexinV-FITC/PI双染细胞凋亡实验提示,与野生型CT26及其阴性对照组相比,Smad4KD细胞活细胞百分比明显降低,早其凋亡及死亡细胞显著增加。而给予外源性TGF-β之后,野生型CT26细胞、阴性对照及Smad4KD细胞的凋亡细胞百分比未有明显变化。而皮下成瘤体内实验提示,与野生型CT26细胞所成皮下肿瘤相比,Smad4KD形成的皮下瘤块明显较小。野生型CT26所成皮下肿瘤体积为5865.73±1630.00mm3,而Smad4KD所成皮下肿瘤体积为955.37±297.96mm3。干扰Smad4使CT26细胞所形成的皮下肿瘤体积显著减小。结论:干扰Smad4抑制CT26细胞增殖及克隆形成,促进其凋亡。
　　第三部分:干扰Smad4促进CT26细胞的迁移能力
　　目的:探讨Smad4蛋白在小鼠结肠癌细胞转移表型中的作用。方法:我们以小鼠结肠癌细胞CT26、阴性对照细胞及CT26-Smad4KD细胞作为研究对象,利用划痕实验、transwell细胞迁移及细胞侵袭实验,评估野生型CT26细胞、阴性对照组及Smad4KD细胞的横向爬行能力、纵向迁移及侵袭能力。然后,我们结合TGF-β与MAPK/JNK抑制剂SP600125,以及MAPK/ERK抑制剂PD98059和U0126,使用transwell细胞迁移实验研究Smad4KD细胞在阻断JNK或ERK通路后,其纵向迁移能力的变化。结果:划痕实验结果表明,划痕36小时后,给予外源性TGF-β后,野生型CT26细胞向无细胞区爬行增多;而Smad4KD细胞在未给予外源性TGF-β条件下,其细胞侧向爬行能力已经明显超过野生型CT26细胞,给予外源性TGF-β刺激后,爬行能力明显增强。此后,transwell细胞迁移实验结果表明,铺细胞24小时后,野生型CT26细胞每个高倍视野下,穿过8um的transwell膜细胞数目为23.4±13.13个,两个阴性对照克隆穿过数分别为24.43±11.43和23.85±15.89个。而敲减Smad4后,其穿过能力明显增强,三个Smad4KD细胞克隆的穿过数目分别为258.14±36.40,204.57±44.77与249.14±47.88个(p<0.05)。使用MAPK/JNK或MAPK/MEK抑制剂能减弱Smad4KD细胞增强的迁移能力。结论:干扰Smad4促进CT26细胞的运动性及侵袭能力。Smad4下调引起的侵袭表型可以被JNK和ERK通路抑制剂减弱。

目录

封面

声明

目录

缩略词表

前言

参考文献

第一部分：CT26-Smad4KD细胞系的建立及鉴定

中文摘要

英文摘要

1 材料和方法：

2 实验结果

3 讨论

参考文献

第二部分：干扰Smad4抑制CT26细胞的增殖，促进其凋亡

中文摘要

英文摘要

1 材料和方法

2 实验结果

3 讨论

参考文献

第三部分：干扰Smad4促进CT26细胞的迁移能力

中文摘要

英文摘要

1 材料和方法

2 实验结果

3 讨论

参考文献

综述：

实验常用缓冲液、试剂配制方法

发表论文

致谢