电压依赖性外向K+通道在纳米SiO2致人血管内皮细胞毒性效应中的作用

摘要

随着纳米材料的发展,人们对纳米颗粒的暴露机会越来越多。纳米颗粒广泛见于纳米材料的生产和使用。此外,工业环境的热加工生产,以及大气环境污染,使得生产工人和普通人群均可接触到它,因此其潜在的健康影响将成为一个重要的研究领域。已有研究证明,纳米颗粒可进入血液系统,分布全身,导致心血管疾病。有研究表明,炎性复合体(a protein complex)可介导炎性反应的发生;胞内K+外流,即降低胞内K+离子浓度,是炎性体激活的前提条件之一。本实验旨在为外向K+通道在炎性反应中的作用提供一定的实验依据。
　　目的:研究探讨电压依赖性外向K+通道(voltage dependent potassium channel,Kv)在纳米二氧化硅(SiO2)致人脐静脉内皮细胞毒性反应中的作用,以及K+外流与炎性反应的关系。
　　方法:第一部分实验体外培养人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)。以细胞正常培养为阴性对照组。单独添加20mg/ml纳米SiO2为阳性对照组。在20mg/ml纳米SiO2基础上,再添加不同剂量的特异性K+通道阻断剂斑蝎毒素MGTX(Margatoxin,终浓度为0.1、1、10、100nM)处理细胞为阻断剂组,检测各组细胞存活率,以及细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、肿瘤坏死因子(TNF-a)以及白介素-6(IL-6)释放量,探讨通道阻断与否对各项指标的影响。第二部分实验运用全细胞膜片钳测定细胞上外向Kv电流,即时加入K+通道阻断剂(TEA、4-AP以及MGTX)验证。由拟合曲线求得各阻断剂该K+电流的半数抑制浓度(ID50)。以正常培养的细胞为对照组,加入不同浓度(20mg/ml、40mg/ml)的纳米SiO2处理细胞,记录Kv最大电流幅值得到最低作用剂量,电流-电压曲线以及通道动力学变化。同时运用免疫荧光技术初步观察细胞膜外向K+通道亚型Kv1.3通道的表达。
　　结果:加入K+通道阻断剂MGTX后,与阳性对照组比较,随着阻断剂剂量增高细胞存活率有升高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。LDH漏出率先降低后升高,最终仍显著低于阳性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。MGTX作用下纳米SiO2诱导细胞释放TNF-a量显著降低,与阳性对照比较差异有统计意义(P<0.05)。低剂量MGTX(0.1nM)即可显著降低细胞IL-6的释放量(P<0.05)。指标标化分析表明,三种K+通道阻断剂中4-AP对纳米SiO2毒性的作用最为显著,MGTX则处于中间位置,TEA的作用最弱。通过全细胞膜片钳模式记录到HUVECs细胞膜上存在一个激活和失活都较缓慢、具有电压依赖性和延迟整流特性的外向电流。K+通道阻断剂TEA、4-AP以及MGTX使得该外向K+电流受到不同程度的抑制。5mM4-AP可完全阻断该电流,且冲洗去除后电流不能恢复。100nM MGTX可部分阻断该电流,且冲洗后电流能部分恢复,这说明所记录的电流是Kv1.3通道的电流。与对照组比较,20mg/ml纳米SiO2使Kv电流最大幅度值增加了63.9％,但差异尚无统计学意义(P>0.05);而40mg/ml纳米SiO2使之增高了120.2%,差异有统计学意义(P=0.0385)。给予细胞不同电压刺激,在纳米SiO2作用下外向Kv电流逐渐增大,与对照比较差异有统计学意义(P<0.05)。通道动力学分析发现,纳米SiO2可使外向Kv通道稳态激活曲线显著左移,半数激活电压V1/2由11.96±1.17mV左移至4.25±1.55mV,斜率因子k由13.54±1.16显著降低至11.45±1.49,与对照比较差异有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光实验观察到,加入纳米SiO2后细胞变为不规则形,细胞膜断裂,细胞核破碎等,表现明显的细胞毒性变化。在细胞膜完整部位荧光强度增强,Kv1.3表达量升高。
　　结论:MGTX可抑制纳米SiO2诱导的人血管内皮细胞毒性反应,且广泛外向型K+通道阻断剂4-AP的抑制作用更显著。HUVECs细胞上存在外向Kv通道,表现延迟整流特性。纳米SiO2可诱导细胞发生毒性反应,外向Kv通道表现为活性增强,开放速率增高,外向K+电流增加。外向Kv通道可能在纳米SiO2致人血管内皮细胞炎性反应中发挥早期信号作用。

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前言

第一部分 K+通道与纳米SiO2致人心血管内皮细胞损伤的关系

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.3 指标测定

1.4 数据处理与统计分析

2 结果

2.1 特异性钾通道阻断剂MGTX对纳米SiO2致细胞存活率的影响

2.2 通道阻断剂对纳米SiO2致细胞 LDH漏出率的影响

2.3 K+通道阻断剂MGTX对纳米SiO2致细胞 TNF-?释放量的影响

2.4 K+通道阻断剂MGTX对纳米SiO2诱导细胞 IL-6释放量的影响

2.5 不同K+通道阻断剂对纳米SiO2诱导细胞毒性作用影响的标化比较

2.6 不同K+通道阻断剂与各毒性指标的相关分析

2.7 纳米SiO2透射电镜图

3 讨论

参考文献

第二部分电压依赖性外向K+通道在纳米SiO2致人血管内皮细胞毒性效应中的作用

1 材料与方法

1.1. 材料

1.2 方法

1.3 数据处理与统计分析

2 结果

2.1 全细胞模式记录HUVECs上外向K+电流

2.2 阻断剂阻断并验证细胞上外向Kv电流

2.3 纳米SiO2对细胞上外向Kv通道的影响

2.4 纳米SiO2对HUVECs细胞膜上Kv1.3蛋白免疫荧光的影响

3 讨论

参考文献

综述 血管内皮细胞离子通道研究进展及其与炎症反应的关系

致谢