L-型电压依赖性钙通道α1亚单位在兔膝骨关节炎软骨细胞基质代谢中的作用及其机制研究

摘要

膝骨关节炎(Knee Osteoarthritis，KOA)是一种常见的以膝关节软骨进行性退变为典型特征的慢性关节疾病。尽管近年来KOA治疗方法和手段不断改进，但总体治疗效果仍不理想，缺乏对KOA发病机制的深入理解是影响其治疗效果的主要原因。
　　关节软骨是骨性关节炎病变时最先和最主要的侵犯部位。关节软骨包括软骨细胞和细胞外基质（主要是Ⅱ型胶原和蛋白聚糖）。骨关节炎(Osteoarthritis，OA)时，各种病理因素均直接或间接地作用于软骨细胞，使其调控的软骨基质合成与降解的动态平衡体系失衡，并最终导致软骨基质的破坏。目前认为，钙调神经磷酸酶(Calcineurin)参与并调控软骨细胞增殖、分化，在关节软骨的发育及骨关节炎的发生、发展中扮演着重要的角色。
　　离子通道(Ionic channels)是镶嵌在细胞膜上的跨膜α-螺旋蛋白，允许特定的一些离子通过，是传递细胞内外信号的重要途径。软骨细胞虽然不是可兴奋性细胞，但是作为活细胞系统，越来越多的实验证实软骨细胞膜具有静息膜电位，并发现了形成静息膜电位的多种通道和膜孔蛋白，如钙激活的钾通道，ATP敏感的钾通道，电压依赖性钾通道，上皮钠通道，电压依赖性钠通道，水通道，氯通道，NDMA受体(N-甲基-D-天门冬氨酸)，瞬时受体电位通道，电压依赖性钙通道等。虽然对每种通道的具体功能尚不完全清楚，但是可以肯定，细胞外各种机械刺激和生化的刺激信号会通过这些通道进而影响软骨细胞的功能。现研究发现多种离子通道调节剂对软骨细胞膜电位产生影响，并影响了软骨细胞的增殖。有研究发现在软骨细胞膜上存在L-型钙通道α1亚基Cav1.2蛋白的表达，使用钙通道阻滞剂维拉帕米降低软骨细胞膜电位达18％以上。电压依赖性钙通道在正常软骨细胞中的功能如何？骨关节炎软骨退变时，通道的改变以及调控机制如何？尚无相关研究报道。
　　采用膜片钳，分子生物学和免疫学等方法，我们首次研究了KOA模型动物膝关节软骨细胞各种电压依赖性钙通道α1亚单位mRNA的表达，并探讨了病理情况下Calcinurin在L-型电压依赖性钙离子通道调控兔膝骨关节炎软骨细胞基质代谢中的作用。研究正常和疾病状态下软骨细胞膜离子通道电生理特征的变化，开发作用于离子通道的药物，可为临床开发治疗KOA提供新的药物靶点，并对软骨细胞移植及软骨组织工程等相关技术的完善提供帮助。
　　第一部分兔膝骨性关节炎(KOA)模型制作及鉴定
　　目的:兔KOA模型制作及鉴定。
　　方法:采用经典Hulth法，制作兔双腿KOA模型。手术后12周，通过观察关节大体情况，HE染色、组织病理学Markin评分、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色、组织切片甲苯胺兰染色和X线片对KOA模型的成功与否进行多方面鉴定。
　　结果:X线片可见，术后12w的KOA组动物膝关节内股骨和胫骨边缘骨赘形成;关节间隙不等宽，内侧较窄，关节面可见骨质硬化。大体标本可见滑膜大部分呈结节样增生，滑液混浊，软骨表面有严重缺损及溃疡形成，软骨下骨暴露，裂纹边缘软骨变软，表面粗糙，呈灰黄色，周围有大量骨赘形成。HE染色可见软骨损伤程度严重，大范围的软骨纤维化，且达及深层，细胞数明显减少，分布不均匀，潮线不连续，钙化层难以分辨;基质严重失染，Mankin评分13-14分。免疫组化发现Ⅱ型胶原表达量比正常组明显减少。组织切片甲苯胺蓝染色发现软骨组织比正常对照组染色程度明显变浅。
　　结论:利用经典Hulth法，成功建立了兔KOA模型。
　　第二部分兔KOA时软骨细胞RT-qPCR内参基因的选择
　　目的:确定培养三代的软骨细胞进行RT-qPCR实验时最佳的内参基因。
　　方法:培养正常和KOA软骨细胞，取前三代细胞，利用RT-qPCR技术对15种管家基因在各代软骨细胞中的表达变化进行分析，通过geNorm与NormFinder软件对管家基因进行稳定性排序，然后用RefFinder软件综合上述两种软件得到的各基因稳定值，对15种管家基因稳定性进行综合排序，得到KOA时最稳定内参基因。
　　结果:15个内参基因表达存在差异，geNorm与NormFinder软件结果略有不同，RefFinder综合结果得出一代最佳匹配基因为RPⅡ和YWHAZ，二代细胞为RPL13a和PPIA，三代细胞为RPL13a和RPⅡ，综合前三代细胞RT-qPCR数据得到三代之前细胞稳定内参基因为YWHAZ和RPⅡ。
　　结论:确定培养三代的软骨细胞进行RT-qPCR实验时最佳的内参基因。
　　第三部分电压依赖性钙离子通道α1亚单位在兔膝骨关节炎软骨细胞基质代谢中的作用
　　目的:探讨KOA时软骨细胞电压依赖性钙离子通道α1亚单位与细胞基质代谢的关系。
　　方法:采用膜片钳技术，观察了兔KOA软骨细胞静息电位的变化。应用RT-PCR技术，观察了兔KOA软骨细胞合成代谢和分解代谢指标的mRNA表达改变，以及各种电压依赖性钙通道α1亚单位mRNA表达的变化。
　　结果:(1)正常和KOA时软骨细胞膜静息电位的变化:正常兔软骨细胞静息电位平均值为-37 mV，OA组细胞为-28 mV。与正常细胞相比，KOA细胞呈去极化表现，静息电位值升高了25.2％(P＜0.01)。(2)正常和KOA时软骨细胞电压依赖性钙离子通道α1亚单位mRNA的表达:本模型条件下，正常兔膝关节软骨细胞仅有Cav1.2，Cav1.3，Cav1.4，Cav2.1，Cav2.2和Cav2.3的mRNA表达，未发现存在Cav1.1，Cav3.1和Cav3.3的mRNA表达。KOA时，软骨细胞Cav1.3，Cav1.4和Cav2.1的mRNA表达增高，分别是正常软骨细胞的4.37，8.96和3.63倍(P＜0.05，P＜0.01)，Cav1.2，Cav2.2和Cav2.3的mRAN表达没有明显改变。(3)正常和KOA时软骨细胞基质合成代谢和分解代谢相关基因的mRNA表达:正常兔膝关节软骨细胞均有选择的10种目的基因mRNA的表达，与正常相比，软骨细胞的合成代谢指标中ColⅡ，aggrecan-1，SOX-9和TGF-β的mRNA明显降低。软骨细胞的分解代谢指标中各种酶的mRNA表达增多，尤其是MMP-1，ADAMTS-4和ADAMTS-5增多显著(P＜0.05)。
　　结论:KOA时通过钙通道增加的钙可能是软骨细胞基质合成代谢减少，分解代谢增加的原因之一。
　　第四部分 Calcinuerin在L-型电压依赖性钙通道调控兔膝骨关节炎软骨细胞基质代谢中的作用
　　目的:探讨L-型电压依赖性钙通道是否是通过Calcinuerin调节了软骨细胞基质代谢。
　　方法:使用RT-PCR方法，首先观察了KOA时软骨细胞CaN和5种NFAT亚型的mRNA表达情况，然后分别使用L-型电压依赖性钙通道阻断剂硝苯地平（10μM），CaN抑制剂环孢素A（CsA，1μM），观察CaN在L-型电压依赖性钙通道调控兔膝骨关节炎软骨细胞基质代谢中的作用。
　　结果:(1)正常和KOA软骨细胞CaN和各亚型NFAT的mRNA表达:正常和KOA兔CnAα，CnAβ，CnB以及5种NFAT的mRNA均有表达。与正常动物相比，KOA兔软骨细胞CnB的mRNA表达没有显著性变化，而CnAα，CnAβ均显著降低，分别是对照组的0.50和0.57倍(P＜0.05)。5种NFAT的mRNA表达变化并不一致。NFATc1降低最为显著，是正常的0.34倍(P＜0.01)，而NFATc2明显升高，是正常组的2.42倍(P＜0.01)，NFATc3，NFATc4和NFATc5的mRNA表达虽有降低趋势，但没有显著性意义。因此我们选取KOA中变化最为明显的CnAα，CnAβ，NFATc1和NFATc2来进行下面的实验。(2) MTS法测定药物对细胞活力的影响:与同时期的溶剂对照DMSO组相比，硝苯地平和CsA作用72 h后，对KOA软骨细胞的活力没有影响(P＞0.05)。(3)硝苯地平和CsA对兔膝骨关节炎软骨细胞代谢的影响:与溶剂对照组的KOA细胞相比，硝苯地平完全阻断了KOA软骨细胞Cav1.2，Cav.1.3和Cav1.4的mRNA表达。10μM硝苯地平增加了软骨细胞内基质成分ColⅡ、agg-1和TGF-β的mRNA表达，降低了分解基质的酶MMP-1，ADAMTS-4和ADAMTS-5的表达，分别是对照组的7.48倍(P＜0.01)，5.16倍(P＜0.05)，4.81倍(P＜0.01)和0.17倍，0.34倍和0.10倍(P＜0.01)。1μM CsA降低了软骨细胞ColⅡ的表达，升高了MMP-1的表达，是对照组的0.25倍和3.27倍(P＜0.01)。
　　与溶剂对照组的KOA细胞相比，10μ M硝苯地平明显升高了CnAα的mRNA表达(P＜0.01)，是对照组的3.28倍，但是却显著降低了NFATc2的表达，是对照组的0.20倍(P＜0.05)。1μM CsA降低了软骨细胞CaAα的表达和升高了NFATc2的表达，是对照组的0.63倍和3.15倍(P＜0.01)。两个药物都没有使KOA软骨细胞的CnAβ和NFATc1的mRNA表达发生改变。
　　结论:KOA时软骨细胞L-型钙通道α1亚单位Cav1.3和Cav1.4的mRNA表达增高，通过减少CaN和增加NFAT2的mRNA表达，减少细胞基质合成代谢和增加基质分解代谢的mRNA表达。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 兔膝骨关节炎(KOA)模型制作及鉴定

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分 兔KOA时软骨细胞RT-qPCR内参基因的选择

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 电压依赖性钙离子通道α1亚单位在兔膝骨关节炎软骨细胞基质代谢中的作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第四部分 Calcinuerin在L-型电压依赖性钙通道调控兔膝骨关节炎软骨细胞基质代谢中的作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 钙通道在软骨形成中的作用

致谢

个人简历