绿豆Aglycin的分离纯化以及几种豆类Aglycin基因的克隆

摘要

Aglycin是Chen等在研究胃肠道多肽激素时从猪小肠中分离并鉴定出的一个生物活性肽，分子量为3742.3D，含37个氨基酸，其中有6个半胱氨酸，分别位于3、7、15、20、22和32位。因氨基端为丙氨酸alanine，羧基端为甘氨酸glycine，故将其命名为Aglycin。经生物信息学分析比对，Aglycin与豆类生物活性肽PA1b一级结构几乎一致，与分离自黄豆的生物活性肽leginsulin同源性高达67％，且PA1b和leginsulin都能与共存于豆科植物中有类似受体蛋白性质的7S球蛋白结合，在豆科植物生长发育中起作用。有意思的是，动物胰岛素和胰岛素样生长因子也能和7S球蛋白结合，所以将这类蛋白统称为豆类胰岛素。
　　豆类胰岛素不仅对植物的生长和发育有重要的作用，还能够作为一种对人和动物无害的有效昆虫毒剂，杀灭象鼻虫等一系列害虫，成为贮存粮食以及农业生产的有前景的生物杀虫剂，除此之外，豆类胰岛素还对糖代谢有一定的调节作用，不仅能够降低糖尿病小鼠空腹血糖，改善胰岛素敏感性，使糖耐量趋向正常，并且对动物体本身无毒副作用。因此豆类胰岛素是一种对植物、昆虫以及哺乳动物有着重要功能和意义的小分子生物活性肽，对它的研究也显得尤为重要。绿豆种子蛋白含量很高，是人们主要的蛋白质来源之一，它是是一种营养全面的食物，具有多重营养和保健功能。但目前对Aglycin的研究主要集中在豌豆和黄豆上，对绿豆Aglycin的研究较少。因此本实验我们希望能纯化出绿豆Aglycin，为其后期研究奠定基础。
　　本实验希望根据前期分离和纯化豌豆Aglycin蛋白的经验，来分离和纯化绿豆Aglycin，以支持后期对不同豆类胰岛素功能的研究。但在纯化过程中并没有分离出绿豆Aglycin，提示不同豆类中的Aglycin的分布和组织定位的不同可能导致其分离纯化方法的不同，因此接下来，克隆出几种豆类种子Aglycin的基因，并分析不同豆类种子胰岛素基因的同源性，以期对豆类胰岛素的基础研究有所助益。
　　本实验完成的工作主要有：
　　1.按照前期纯化豌豆Aglycin的方法，探索分离纯化绿豆Aglycin的方法；
　　2.克隆出几种豆类的Aglycin基因；
　　3.比较并分析了几种豆类Aglycin基因以及氨基酸序列的差异和同源性。
　　研究结果显示，不同豆类的Aglycin基因以及氨基酸序列之间虽有较高的同源性，但差异还是比较突出，这些差异可能导致了Aglycin在不同的豆类中的分布和组织定位有所不同，那么分离和纯化它们的办法可能就会不完全一样。故而不同豆类的Aglycin分离和纯化方法需进一步优化。

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1 绪 论

1.1 植物多肽激素的研究进展

1.2 Aglycin的发现及其基本特征

1.3 Aglycin的生理功能研究进展

1.4 绿豆蛋白研究进展

1.5 蛋白质分离纯化方法分析

1.6 本研究的目的及意义

2 实验材料与仪器

2.1 实验植物、菌株、质粒及细胞

2.2 菌种培养所用培养基

2.3 生化试剂

2.4 主要仪器设备

2.5 实验室常用溶液的配制

3 实验方法

3.1 绿豆Aglycin的纯化

3.2 几种豆科植物总RNA的提取

3.3 RT-PCR

3.4 引物设计与PCR扩增

3.5 E.coli DH5α感受态细胞的制备及转化

3.6 蓝白斑筛选

3.7 质粒抽提

4 实验结果

4.1 绿豆Aglycin分离纯化

4.2 几种豆类种子Aglycin基因的克隆及比对分析

5 讨论与展望

5.1 绿豆Aglycin纯化条件的探讨

5.2 豆类Aglycin基因的克隆

5.3 不同豆类Aglycin的同源性分析

5.4 有待继续开展的工作

致谢

参考文献

附录 主要缩写对照表