嘌呤受体P2X7和P2Y2在大鼠骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化中的作用

摘要

目的：
　　探讨嘌呤受体P2X7和P2Y2在大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨和成脂分化中的作用。
　　方法：
　　1.体外实验
　　（1）受体表达检测：免疫荧光染色检测BMSCs上嘌呤受体P2X7和P2Y2的表达，RT-qPCR及Western-blot检测受体表达与细胞分化状态的关系；
　　（2）细胞增殖及活性检测：CCK-8试剂盒检测激活嘌呤受体P2X7和P2Y2对BMSCs增殖及细胞活性的影响；
　　（3）成骨分化检测：RT-qPCR及Western-blot检测成骨指标（RUNX2，ALP及OPN）的表达；茜素红染色检测钙结节形成；ALP（碱性磷酸酶）染色检测ALP生成；
　　（4）成脂分化检测：RT-qPCR及Western-blot检测成脂指标（PPARγ，FABP4及Adipsin）的表达；油红O染色检测脂滴生成；
　　（5）基因沉默技术：siRNA分别沉默P2X7和P2Y2受体，检测嘌呤受体P2X7和P2Y2在BMSCs成骨和成脂分化中的作用；
　　（6）信号通路检测：Western-blot检测激活嘌呤受体P2X7和P2Y2后其下游被激活的信号通路。
　　2.体内实验
　　（1）动物模型：用小鼠卵巢切除骨质疏松模型研究在体内激活嘌呤受体 P2X7后对松质骨、皮质骨及髓腔内脂肪生成的影响；
　　（2）组织形态学分析：microCT检测松质骨和皮质骨骨参数；H&E染色检测松质骨骨参数和髓腔内脂滴形成。
　　结果：
　　1.SD大鼠BMSCs上表达嘌呤受体P2X7和P2Y2；在成骨分化过程中P2Y2受体表达逐渐减少，而P2X7受体表达逐渐增加；在成脂分化过程中P2Y2受体表达逐渐增多，而P2X7受体表达逐渐减少。
　　2. BzATP通过激活P2X7受体促进BMSCs成骨指标表达、ALP生成及钙结节形成，抑制成脂指标表达及脂滴的形成。P2X7受体的siRNA和特异性拮抗剂（BBG）完全阻止了BzATP的作用。microCT显示BzATP可以减少因卵巢切除所致的松质骨丢失，但对皮质骨的参数没有影响；H&E染色显示BzATP可以增加卵巢切除小鼠的松质骨数目和体积，使骨髓腔内脂滴生成减少。
　　3. BzATP刺激使ERK1/2和JNK磷酸化增加，BBG抑制BzATP诱导的ERK1/2和JNK的磷酸化；阻滞ERK1/2和JNK信号通路后，BzATP对BMSCs成骨和成脂基因表达的影响消失。
　　4. UTP（三磷酸尿苷）通过激活P2Y2受体抑制BMSCs成骨指标表达、ALP生成及钙结节形成，促进BMSCs成脂指标表达及脂滴的形成。
　　5. UTP刺激使ERK1/2磷酸化增加，P2Y2受体siRNA抑制UTP诱导的ERK1/2磷酸化；阻滞ERK1/2信号通路24h后，UTP对BMSCs成骨和成脂基因表达的影响消失。
　　结论：
　　1. BzATP通过P2X7受体激活ERK1/2和JNK信号通路，促进大鼠BMSCs成骨分化、抑制其成脂分化；BzATP可以减少小鼠卵巢切除导致的松质骨丢失。
　　2. UTP通过激活P2Y2受体促进大鼠BMSCs成脂分化、抑制其成骨分化；ERK1/2信号通路介导这个过程的起始阶段。

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前言

参考文献

中文摘要

英文摘要

第一部分嘌呤受体P2X7在大鼠骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化中的作用

引言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分嘌呤受体P2Y2在大鼠骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化中的作用

引言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

综述: P2X7受体在骨代谢中的作用

附 录 1 英文缩略词表

附 录 2 研究生期间发表的论文

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