成骨生长肽（10-14）对大鼠骨髓间充质干细胞成脂、成骨分化的影响

摘要

以往的实验证据表明，骨髓间充质干细胞(MSCs)具有多向分化潜能，在一定条件下可定向分化为成骨细胞和脂肪细胞，此已分化的成骨细胞、脂肪细胞可以去分化再分化，并且二者之间存在“此消彼长”的关系。研究发现，在各种类型的骨质疏松病人中，其骨髓基质中脂肪细胞的增多并伴随松质骨骨量低下。成骨生长肽(OGP)可促进骨形成、刺激骨折愈合、增加小梁骨骨密度；过度表达OGP基因的转基因小鼠，尤其是雌性鼠，因其骨形成增加而有着较高的骨量峰值；在成骨性细胞及起源于人及其它哺乳动物的骨髓基质细胞培养中，OGP调节细胞的增殖、碱性磷酸酶活性及基质矿化。正常生理状态下，在啮齿类动物和人类血液中80～90％的OGP是以与成骨生长肽结合蛋白(OGPBF)相结合的形式存在的。OGP从OGP-OGPBP复合物中分离出来后，在蛋白水解酶作用下，产生OGP的C末端五肽——OGP(10-14)。OGP(10-14)是具有OGP全部生物活性的最小片段，它通过激活靶细胞内Gi蛋白-促有丝分裂素激动蛋白(MAP)激酶信号途径发挥其生物学作用。以上实验结果促使我们对OGP(10-14)预防和治疗骨质疏松的机理进行探讨。OGP(10-14)是否通过调节MSCs的成骨、成脂分化来影响骨的形成尚未可知。 在本研究中，OGP(10-14)采用Boc策略和Fmoc策略的固相多肽合成法手工合成，经分析型HPIC鉴定纯度>95％，质谱鉴定分子量与理论值相符。生物活性鉴定结果显示，OGPI(10-14)对NIH3T3细胞具有促增殖作用，剂量反应曲线呈一“近似钟形”，发挥最大生物活性的浓度为10<'-10>M。用贴壁筛选法分离MSCs，传3代后再进行成脂、成骨诱导，通过相差显微镜下观察细胞生长形态学变化，并行油红O染色、碱性磷酸酶(ALP)染色、Von KosSa钙染色、细胞内甘油三酯(TG)和ALP活性的测定，半定量RT-PCR分析成脂相关性基因PPKRγ2，、LPL、aP<,2>、C/EBP及成骨相关性基因cbfal、ALP、OC的表达情况，进而观察OGP(10-14)在大鼠MSCs成骨、成脂分化中的作用。 本实验结果显示，不管是对rMSCs用10<'-10>M OGP(10-14)预处理后再成脂诱导还是在成脂诱导培养体系中直接加入10<'-10>M OGP(10-14)，其成脂分化与对照组相比明显受抑，表现为所形成的脂肪细胞数量减少、细胞内甘油三醑水平降低。同样，对rMSCs用10<'-10>M OGP(10-14)预处理后再成骨诱导或在成骨诱导培养体系中直接加入10<'-10>MOGP(10-14)，均可促进其成骨分化，ALP阳性细胞及所形成的骨样小结明显增多，细胞内ALP活性也明显高，且OGP(10-14)促进rMSCs成骨分化可不依赖于地塞米松的存在，但地塞米松(10<'-10>M)与OGP(10-14)(10<'-10>M)联合作用时，其效应大于单一因素的作用，呈现出显著的协同作用。不管是OGP(10-14)处理组还是对照组，均可探及cbfal和PPARγ2基因的表达；至于ALP,OC，LPL, aP<,2>和C/EBP，其表达水平非常低或未探及表达；与对照组比较，对rMSCs用10<'-10>M OGP(10-14)预处理7天可显著提高cbfal基因的表达水平，同时抑制PPARγ2基因的表达。 本实验证实成骨细胞与脂肪细胞均可由MSCs分化而来；OGP(10-14)可以通过抑制MSCs向脂肪细胞的分化并促进其分化为更多的成骨细胞，从而有效地促进骨形成；OGP(10-14)对rMSCs成脂、成骨分化的影响可能在细胞定向分化阶段而非细胞成熟阶段；OGP(10-14)具有预防和治疗骨质疏松的潜在临床应用价值。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

立题依据

一、材料和方法

二、实验结果

三、讨论

四、结论

附图

参考文献

在学期间的研究成果

致谢