肿瘤坏死因子-α促进脂肪酸跨血管内皮细胞转运及介导心肌胰岛素抵抗的作用及其机制

摘要

目的：炎症信号和脂质信号与胰岛素抵抗密切相关，但是二者的相互作用及其机制众说纷纭。肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）是血浆中重要的炎症信号分子，棕榈酸（Palmitic acid，PA）是人体内含量最多的中长链饱和脂肪酸。本课题以TNF-α和PA为炎症和脂质信号的代表，研究TNF-α能否通过改变微血管对PA的穿胞（Transcytosis）转运，加强PA促心肌细胞胰岛素抵抗的作用，并对自噬和核转录因子-κB（Nuclear factor-κB，NF-κB）信号在该过程中的相互作用进行探讨。
　　方法：（1）成年大鼠心肌微血管内皮细胞（Cardiac microvascular endothelial cells, CMECs）培养接种在 Transwell上层小室中，将饱和脂肪酸的荧光类似物，C1-BODIPY-C12（BODIPY-PA）与白蛋白（Albumin）的复合物加入上层小室，通过竞争抑制的方法建立检测脂肪酸穿胞转运模型。（2）在蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）、NF-κB、自噬信号通路的抑制剂存在与否的情况下，利用此模型检测 TNF-α对脂肪酸跨内皮细胞穿胞的影响。（3）使用转录因子活性测定、western blot、GFP-LC3过表达等方法检测内皮细胞中PKC转位、NF-κB活性及自噬相关蛋白表达的变化。（4）CMECs和原代成年大鼠心肌细胞共培养模型中，对小室上层的CMECs给予TNF-α及各信号抑制剂处理后，在小室上层加入PA，使PA跨过内皮细胞转运到小室下层，刺激小室下层的心肌细胞。然后，检测心肌细胞在胰岛素作用下对2-NBDG的摄取。（5）在动物实验中，对C57BL/6J小鼠分别给予TNF-α、PA、NF-κB抑制剂Pyrrolidinedithiocarbamic acid（PDTC）或自噬抑制剂3-Methyladenine（3MA）处理后，使用小动物正电子发射断层扫描（Positive emission tomography, PET）检测胰岛素刺激下心脏的18F-FDG摄取量，计算百分注射剂量率（％ID/cc）。处死小鼠后收集组织样本，使用γ计数仪直接测定心脏放射值，并通过western blot方法检测心脏内胰岛素下游信号的变化、通过免疫组化检测心脏内脂肪酸转运蛋白4（Fatty acid transport protein4, FATP4）的表达及分布。
　　结果：（1）我们利用荧光标记的饱和脂肪酸类似物 BODIPY-PA，在原代培养的CMECs建立了一个可连续观察6小时的体外脂肪酸穿胞模型。在此模型中，我们观察到BODIPY-PA经CMECs的穿胞表现为时间依赖性和浓度依赖性，可被PA抑制。由 BODIPY-PA的“荧光值-浓度”标准曲线计算可得各浓度下BODIPY-PA的总转运量和穿胞量。我们选取穿胞量占总转运量比例较大，曲线平滑性较好的BODIPY-PA40μM组进行实验。（2）利用体外穿胞模型可观察到TNF-α增加脂肪酸跨CMECs的穿胞，通过siRNA干扰发现此作用依赖于FATP4的表达。自噬抑制剂3MA或 NF-κB结合序列寡核苷酸片段（Oligodeoxynucleotide，ODN）都可以抑制TNF-α增加FATP4表达以及促脂肪酸穿胞的作用。（3）TNF-α可以上调 NF-κB的转录活性，同时激活自噬，增加LC3-II的表达、增加LC3自噬小体含量、增加Beclin1的表达。NF-κB ODN可以抑制TNF-α引起的LC3-II表达增加、Beclin1表达增加以及LC3自噬小体增多。反之，3MA也可以抑制 TNF-α对 NF-κB的激活。通过分离胞膜蛋白发现TNF-α促进PKCδ从细胞浆转位到细胞膜，PKCδsiRNA可以阻断TNF-α促脂肪酸穿胞及激活NF-κB和自噬的作用。（4）PA单独孵育心肌细胞，可呈浓度依赖性地减弱胰岛素对 Akt和 GSK3β的磷酸化，减少胰岛素刺激下心肌细胞对2-NBDG的摄取。在体外CMECs-心肌细胞共培养实验中，跨内皮细胞转运到小室下层的PA减少了胰岛素刺激下心肌细胞对2-NBDG的摄取；TNF-α孵育CMECs加强了PA对心肌细胞胰岛素信号的损伤作用，而TNF-α的这种加强作用可以被3MA或PDTC抑制。（5）小动物PET结果显示，给予PA的小鼠在胰岛素刺激下表现出较少的心脏18F-FDG摄取，TNF-α注射进一步加重了PA引起的摄取减少，而TNF-α的作用可以被3MA或PDTC注射阻断。心脏γ计数检测结果与PET扫描结果一致。Western blot对胰岛素信号相关蛋白的检测结果显示，在胰岛素刺激下，相比于TNF-α和PA单独处理的小鼠，TNF-α+PA联合处理组小鼠心脏表现出更低的Akt和 GSK3β磷酸化水平，3MA或 PDTC可改善TNF-α+PA联合处理引起的心脏胰岛素抵抗。免疫组化结果显示TNF-α处理的小鼠心脏微血管中FATP4表达上调，而3MA或PDTC处理可以减少此上调效应。结论：TNF-α通过激活心脏微血管内皮细胞自噬和NF-κB信号，二者互相加强，共同促进PA在CMECs的穿胞转运，进而加重PA所引起的心肌细胞胰岛素抵抗。

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材料和方法

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参考文献

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综述: 自噬在内皮细胞及相关疾病中的研究进展

附篇内源性神经酰胺促进早期动脉粥样硬化阶段oxLDL在内皮下的沉积

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