sFRP4在常染色体显性遗传性多囊肾中介导Wnt/β-catenin信号通路和PI3K/AKT信号通路诱导凋亡的作用

摘要

目的：研究分泌型卷曲相关蛋白4（sFRP4）在常染色体显性遗传性多囊肾病（ADPKD）中的表达及其引发细胞凋亡的机制。
　　方法：1.体内实验：（1）血标本实验：收集12例正常人和20例已确诊ADPKD患者的血浆，ELISA法检测血浆sFRP4的水平。（2）组织学实验：取对照肾组织和ADPKD肾组织各3例。免疫组织化学法观察sFRP4在肾脏中的表达；TUNEL法检测肾组织中细胞凋亡；RT-PCR法检测人肾组织中 sFRP4 mRNA、caspase-3 mRNA、GSK3βmRNA、β-catenin mRNA、cyclind1 mRNA水平；Western blot法检测肾组织中sFRP4、cleaved-caspase-3、pro-caspase-3、p-GSK3β、GSK3β、β-catenin、p-β-catenin、cyclind1、AKT、p-AKT蛋白表达水平。（3）斑马鱼实验：斑马鱼受精卵内显微注射200pg sFRP4 mRNA，55h后光镜下观察sFRP4过表达后斑马鱼原肾囊肿形成情况。2.体外实验（细胞学实验）：HEK-293T细胞分为正常对照组、PcDNA6对照组和sFRP4组，流式细胞术检测各组细胞凋亡率；Western blot法检测cleaved-caspase-3、pro-caspase-3蛋白表达情况。HEK-293T细胞分为对照组、Wnt3α组和Wnt3α+sFRP4共转染组，Western blot法检测β-catenin、p-AKT、AKT、NF-κB、Bax、cleaved-caspase9、pro-caspase9蛋白表达水平。
　　结果：1.ADPKD患者血浆中sFRP4水平显著高于健康人。2.相比对照组，免疫组化法观察到sFRP4在ADPKD患者肾小管上皮细胞胞浆中表达明显升高。3.TUNEL法检测结果示肾小管上皮细胞凋亡增加。4.ADPKD肾组织中sFRP4、caspase-3、β-catenin、cyclind1 mRNA水平均高于对照组，而GSK3βmRNA水平下降。Western blot结果表明 sFRP4、cleaved-caspase-3、p-GSK3β、β-catenin、cyclind1蛋白表达高于对照组，而GSK3β、p-β-catenin、p-AKT/AKT低于对照组。5.斑马鱼受精卵内注射sFRP4 mRNA后可见原肾囊肿形成。6.HEK-293T细胞过表达sFRP4，可致细胞凋亡率增加，凋亡相关蛋白Bax、cleaved-caspase9、cleaved-caspase-3表达升高；β-catenin以及抗凋亡相关蛋白p-AKT、NF-κB表达下降。
　　结论：sFRP4在ADPKD患者的血液及肾组织中显著升高，过表达sFRP4可诱导斑马鱼前肾囊肿的发生。sFRP4通过抑制经典Wnt/β-catenin信号通路以及PI3K/AKT信号通路，可诱导ADPKD肾组织的异常凋亡增加，推测sFRP4的异常增高是造成ADPKD患者正常肾组织丢失以及囊肿不断扩大的机制之一。

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前言

材料与方法

一，实验材料

二，实验方法

结果

1.sFRP4在ADPKD中高表达

2. sFRP4诱导斑马鱼原肾囊肿形成

3. sFRP4诱导ADPKD肾组织凋亡增加

4.经典Wnt/β-catenin信号通路相关指标的表达

5. PI3K/AKT信号通路相关指标的表达

讨论

参考文献

综述: Wnt信号通路在多囊肾病中的作用和机制

致谢