塞来昔布调节自噬在非酒精性脂肪性肝病中的作用研究

摘要

目的：非酒精性脂肪性肝病目前已成为全球慢性肝脏疾病的首要原因之一，它是多种原因（排除长期酗酒、药物等）导致大量脂肪在肝脏过度沉积引起的一种疾病。众所周知，胰岛素抵抗、脂质代谢紊乱、氧化应激、炎症、自噬流受阻、凋亡/坏死等都可以导致非酒精性脂肪性肝病。塞来昔布是一种选择性的COX-2抑制剂，具有解热、镇痛、抗炎等功效，临床上常常被用来缓解疼痛和治疗风湿性关节炎。最新研究发现，塞来昔布可以改善非酒精性脂肪性肝病，但具体机制尚不明确。
　　方法：体外实验中培养肝L02细胞，予以200μM-400μM的棕榈酸处理12h-24h，制作肝细胞脂变模型，以油红O苏木素染色和甘油三酯试剂盒检测肝L02细胞脂变程度，同时以CCK8法检测细胞活力。细胞脂变过程中Western blot检测LC3 II/I、p62蛋白等自噬流标志物和COX-2表达水平。L02细胞脂变过程中分别加入不同浓度自噬诱导剂雷帕霉素或自噬抑制剂氯喹，同上检测细胞自噬流变化和脂变情况。另外以siRNA干扰COX-2，检测沉默COX-2后棕榈酸诱导L02细胞脂变过程中自噬流水平变化。在此基础上，肝细胞脂变过程中加入COX-2抑制剂塞来昔布（20μM），同上Western blot和RFP-GFP双荧光系统检测自噬流水平，观察细胞脂变情况。动物模型中，SD大鼠高脂饮食4周后，同时给予塞来昔布（20mg/kg/day）灌胃治疗4周，麻醉后处死，观察肝脏HE染色、检测肝脏脂质沉积，同时检测血生化指标ALT、AST、TG和TC。
　　结果：棕榈酸可诱导肝L02细胞脂变，油红O苏木素染色胞浆内出现红色囊泡样脂滴，细胞TG含量增加，呈剂量和时间依赖性。在脂变早期，自噬流被激活，LC3 II/I增高、p62降低；而在脂变后期，自噬流受阻，LC3 II/I和p62均增高，同时COX-2的表达也增高。L02细胞脂变过程中予以雷帕霉素激活自噬后，可以改善肝细胞脂变程度；但予以氯喹抑制自噬，可加剧肝细胞脂变程度。siRNA和塞来昔布均可抑制COX-2表达，LC3 II/I增高、p62降低，部分恢复脂变肝细胞自噬流。另外，在棕榈酸诱导L02细胞脂变过程中加入塞来昔布，RFP-GFP自噬双荧光系统检测荧光斑块增多，代表自噬溶酶体的红色荧光斑块进一步增多，自噬流部分恢复，且肝细胞脂变情况有明显改善。大鼠脂肪肝模型中，高脂饮食大鼠体重高于对照组，血ALT、AST、TG、TC明显高于对照组，肝脏脂变程度也较为严重；在予以塞来昔布灌胃治疗后，大鼠体重、肝脏脂变及血ALT、AST、TG、TC均有改善。
　　结论：自噬参与肝细胞脂变。在脂变早期，自噬流被激活，而后期受阻，COX-2增加。塞来昔布可下调COX-2恢复自噬流，改善细胞脂变。在脂肪肝大鼠模型中，塞来昔布可改善肝脏脂变程度。

目录

声明

英文缩略词表

一、引言

二、材料和方法

1. 材料

2. 实验方法

三、实验结果

1. 棕榈酸诱导肝L02细胞脂变呈剂量和时间依赖性

四、讨 论

五、课题展望

参考文献

综述：脂质氧化代谢产物在非酒精性脂肪性肝病发病机制中的作用研究

致谢