肝脏损伤的新保护措施研究

摘要

本文分为以下几个部分进行探讨：
　　第一部分 利拉鲁肽对ConA诱导的可逆性及致死性小鼠急性肝损伤的保护效果
　　目的:探讨利拉鲁肽对ConA诱导的可逆性及致死性小鼠急性肝损伤的保护效果。
　　方法:按照15mg/kg或25mg/kg体重的量尾静脉注射ConA分别构建可逆性或致死性小鼠急性肝损伤模型。于ConA造模前的3天起早晚皮下给予利拉鲁肽（200μg/kg）。对于致死性小鼠急性肝损伤模型，在ConA造模后的72h内观察小鼠存活情况并记录。对于可逆性小鼠急性肝损伤模型，在ConA造模后的12h处死小鼠并取血浆检测肝功能。肝脏组织标本分别行H&E和TUNEL染色，以检测肝脏的急性损伤程度和肝脏细胞凋亡的数量。使用肝脏组织总蛋白分别检测MDA及SOD的水平，同时使用RT-PCR检测iNOS和COX-2的mRNA水平以反映组织氧化应激损伤的程度。最后使用RT-PCR检测肝脏组织中相关炎症因子的变化情况，并使用ELISA检测血浆当中IL-6及IFN-γ的水平。
　　结果:致死剂量的 ConA会导致小鼠在造模后72小时内大量死亡，而当给予利拉鲁肽预处理后，小鼠存活率得到了明显的提升（P<0.05）。当小鼠静脉给予非致死剂量的ConA12小时后，其肝功能出现了明显的损害（P<0.001），而当小鼠给予利拉鲁肽预处理后，其肝功能得到了极强的保护，血浆谷丙转氨酶（sALT）与谷草转氨酶（sAST）值与ConA组相比有显著的统计学差异（P<0.01）。组织病理学检测发现，ConA会引起小鼠肝脏内出现红细胞淤积、细胞核消失及片状细胞坏死等病理改变，而利拉鲁肽预处理能明显减轻这些病理损害。TUNEL染色结果也证实利拉鲁肽预处理能明显减轻ConA导致的肝细胞凋亡。ConA会引起小鼠肝脏组织内 MDA含量明显上升、SOD含量明显下降，而小鼠经过利拉鲁肽预处理后其体内MDA含量会显著降低同时SOD含量也明显升高。RT-PCR检测iNOS和COX-2的mRNA水平变化也证实利拉鲁肽预处理能明显减轻ConA引起的氧化应激损伤。最后，通过RT-PCR检测一些常见的炎性指标，如IL-2、IL-6、IFN-γ、MCP-1的mRNA水平的变化发现，ConA会明显引起这些炎性因子的表达上调，而当小鼠预处理利拉鲁肽后，IL-2、IL-6、IFN-γ、MCP-1的表达明显降低。
　　结论:利拉鲁肽通过减轻组织内氧化应激及炎性损伤等途径，明显减轻ConA所诱导的小鼠急性肝脏损伤。
　　第二部分 利拉鲁肽对ConA诱导的T淋巴细胞以及巨噬细胞活化的影响
　　目的:探讨利拉鲁肽对ConA诱导的小鼠体内T淋巴细胞及巨噬细胞活化的影响。
　　方法:按照15mg/kg体重的量尾静脉注射ConA构建可逆性小鼠急性肝损伤模型。于ConA造模前的3天起早晚皮下给予利拉鲁肽（200μg/kg）。小鼠在ConA注射后12小时处死，将肝脏组织固定后行CD3、CD68免疫组织化学染色，以检测肝脏组织中T淋巴细胞和巨噬细胞的浸润情况。收集肝脏内的单个核细胞，使用流式细胞术检测CD3+CD69+、F4/80+MHC-Ⅱ+、F4/80+CD86+细胞的比例，以反映肝脏内浸润的T淋巴细胞和巨噬细胞的活化情况。收集脾脏内的单个核细胞，使用流式细胞术分别检测CD3+CD69+、CD4+CD25+、CD4+CD62L+、CD4+CD69+、CD8+CD25+、CD8+CD62L+、CD8+CD69+、F4/80+MHC-Ⅱ+、F4/80+CD80+、F4/80+CD86+细胞的比例,以反映脾脏内 T淋巴细胞及巨噬细胞的活化情况。
　　结果:小鼠在静脉给予ConA的刺激之后出现明显的急性肝损伤，利拉鲁肽预处理明显保护小鼠肝损伤。CD3及CD68免疫组织化学染色显示小鼠在ConA刺激之后，其肝脏内CD3+T淋巴细胞及CD68+巨噬细胞浸润明显增加，同时当小鼠预先给予利拉鲁肽后，肝脏内CD3+T淋巴细胞及CD68+巨噬细胞浸润数量并未减少，两组阳性细胞计数无统计学差异（ P>0.05）。流式细胞术检测肝脏组织内 CD3+CD69+、F4/80+MHC-Ⅱ+、F4/80+CD86+细胞的比例显示，ConA组小鼠肝脏内浸润的T淋巴细胞及巨噬细胞的活化比例与ConA+LRG组小鼠无差异，说明利拉鲁肽并不能抑制肝脏局部浸润的T淋巴细胞和巨噬细胞活化。流式细胞术检测脾脏内 CD3+CD69+、CD4+CD25+、CD4+CD62L+、CD4+CD69+、CD8+CD25+、CD8+CD62L+、CD8+CD69+细胞的比例显示，ConA能明显引起脾脏内T淋巴细胞活化，且利拉鲁肽预处理也不能抑制这些表面标记的活化。与此同时，流式细胞术检测脾脏内F4/80+MHC-Ⅱ+、F4/80+CD80+、F4/80+CD86+细胞的比例，结果显示利拉鲁肽并不会上调MHC-Ⅱ的表达，但是会促进CD80和CD86分子的活化，而利拉鲁肽同样不会抑制这些分子的活化。RT-PCR检测TNF-α和IL-1β的mRNA水平变化，结果显示ConA组和ConA+LRG组表达无差异（P>0.05），说明利拉鲁肽对ConA引起的巨噬细胞释放TNF-α和IL-1β无影响。
　　结论:利拉鲁肽对ConA诱导的T淋巴细胞及巨噬细胞活化无明显影响，对ConA诱导的巨噬细胞释放TNF-α和IL-1β无影响。
　　第三部分 利拉鲁肽对ConA诱导的小鼠急性肝损伤的保护效果与抑制HMGB1的释放有关
　　目的:探讨利拉鲁肽对 ConA诱导的小鼠急性肝损伤的保护效果与肝实质细胞HMGB1的核浆迁移及释放的关系。
　　方法:按照15mg/kg体重的量尾静脉注射ConA构建可逆性小鼠急性肝损伤模型。于ConA造模前的3天起早晚皮下给予利拉鲁肽（200μg/kg）。在ConA注射后的6小时、12小时和24小时分别处死小鼠并取血浆检测肝功能。肝脏组织标本经固定后行HMGB1免疫组织化学染色，以观察肝脏实质细胞在 ConA刺激后的不同时间点 HMGB1的核浆迁移情况。通过ELISA检测各个时间段血浆内HMGB1的含量以观察HMGB1向细胞外释放的情况。最后通过RT-PCR检测小鼠肝脏组织内HMGB1的受体TLR4和RAGE在mRNA水平的变化情况。
　　结果:小鼠在静脉给予ConA的刺激之后能发生明显的急性肝损伤，且在给予ConA后的不同时间段肝脏损伤程度不尽相同。而小鼠在预先给予利拉鲁肽的情况下，各个时间段肝脏损伤均能得到极强的保护。肝脏组织 HMGB1免疫组化染色结果显示 ConA能在体内注射后的早期（即6小时和12小时）强烈的导致HMGB1的核浆迁移，但在ConA注射24小时后无明显的HMGB1核浆迁移现象。与此同时我们发现，当小鼠给予利拉鲁肽治疗后，各个时间点内HMGB1的核浆迁移情况均被明显的抑制。血浆ELISA结果也显示ConA刺激后HMGB1会从细胞内释放到细胞外进而进入血循环，但当给予利拉鲁肽治疗后HMGB1进入血循环的量也明显减少。RT-PCR检测肝脏组织内TLR4和RAGE的表达，结果显示利拉鲁肽能明显抑制HMGB1受体的上调表达。
　　结论：利拉鲁肽通过显著抑制ConA诱导的HMGB1的核浆迁移及释放而达到保护小鼠急性肝损伤的效果。
　　第四部分 下调肝脏细胞核内HMGB1表达对小鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用
　　目的：探讨使用 HMGB1-siRNA下调肝脏细胞核内 HMGB1的表达对小鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护效果。
　　方法：小鼠在麻醉状态下，夹闭其部分肝动脉后在32℃温箱中热缺血1小时，然后恢复其血流灌注6小时，建立可逆性肝缺血再灌注损伤（IRI）模型。于术前48小时通过小鼠尾静脉注射HMGB1-siRNA以达到干扰肝脏实质细胞内HMGB1表达的目的。小鼠于再灌注6小时后处死并取血浆检测肝功能以反映肝脏组织损伤的程度。肝脏组织标本分别行H&E、MPO以及TUNEL染色以检测肝脏的急性损伤程度、中性粒细胞浸润情况和肝脏细胞凋亡的数量。小鼠在再灌注0小时处死后留取肝脏组织标本，分别行HMGB1免疫组化染色和胞浆蛋白Western检测，以观察缺血阶段HMGB1的核浆迁移情况。与此同时，通过ELISA检测再灌注6小时后血浆内HMGB1的含量，以反映再灌注后HMGB1向血循环内释放的情况。最后，通过RT-PCR技术检测肝脏组织中 HMGB1下游相关炎症因子以及受体的变化情况。
　　结果：小鼠在热缺血1小时再灌注6小时后，出现了严重的肝功能损害。小鼠于术前48小时静脉注射HMGB1-siRNA后，能明显下调肝脏实质细胞核内HMGB1的表达（约70％）。小鼠在下调肝脏细胞核内HMGB1表达后，对缺血再灌注损伤具有很好的保护效果（P<0.01）。肝脏组织病理学检测也证实下调肝脏实质细胞核内 HMGB1的表达能够有效减轻IRI导致的肝细胞坏死、中性粒细胞浸润和肝细胞凋亡。小鼠肝脏再灌注0小时的免疫组化及胞浆蛋白Western检测显示，下调肝脏细胞核内HMGB1表达后能明显减少缺血阶段HMGB1的核浆迁移情况。血浆ELISA结果也显示，下调细胞核内HMGB1表达能减少再灌注阶段HMGB1向血循环内的释放。RT-PCR检测结果显示，使用HMGB1-siRNA下调肝脏细胞核内HMGB1表达后，能明显减轻损伤相关炎性分子的上调表达并抑制HMGB1受体的表达。
　　结论：通过 HMGB1-siRNA下调肝脏细胞核内 HMGB1的表达能明显减轻小鼠肝脏缺血再灌注损伤。

目录

声明

华中科技大学博士学位论文创新点概述

缩写及中英文对照

主要仪器及设备

前言

参考文献

第一部分 利拉鲁肽对ConA诱导的可逆性及致死性小鼠急性肝损伤的保护效果

引言

一、实验材料及方法

二、结果

讨论

参考文献

第二部分 利拉鲁肽对ConA诱导的T淋巴细胞及巨噬细胞活化的影响

引言

一、实验材料及方法

二、结果

讨论

参考文献

第三部分 利拉鲁肽对ConA诱导的小鼠急性肝损伤的保护效果与抑制HMGB1的释放有关

引言

一、实验材料及方法

二、结果

讨论

参考文献

第四部分 下调肝脏细胞核内HMGB1表达对小鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用

引言

一、实验材料及方法

二、结果

讨论

参考文献

综述:HMGB1与肝脏疾病的研究进展

致谢