关于自组装多肽缓释紫杉醇促进大鼠脊髓损伤功能恢复的研究

摘要

目的：构建自组装多肽缓释体系RADAmix-Taxol，研究其药物控释规律；建立SD大鼠脊髓挫伤模型，将RADAmix-Taxol植入大鼠脊髓损伤区域，探讨该缓释体对大鼠脊髓损伤修复的效果，探索脊髓损伤新的治疗途径。
　　方法：经固相合成法合成 RADA16及 RADA-FGL多肽分子，RADA16与RADA-FGL以1:1比例混合后行程多肽分子混合物RADAmix，加入稀释的紫杉醇溶液混匀，经超声振荡后形成1%浓度的多肽溶液 RADAmix-Taxol，经DMEM/F12培养基触发自组装后使用原子力学显微镜观察该凝胶的微观结构，检测紫杉醇药物释放规律；体外培养大鼠大脑皮质神经元细胞，使用不同浓度的紫杉醇干预3天后固定染色，验证紫杉醇对于神经元轴突生长的促进作用；使用微管解聚剂 Nocodazole验证紫杉醇体外促进神经元轴突生长的微管稳定作用机制；使用RADAmix和紫杉醇联合干预，观察RADAmix与紫杉醇联合使用对于紫杉醇活性的影响及对神经元轴突生长的影响；使用MASCISC打击法（打击棒头端直径2.5mm，打击高度25mm，打击重量10g）制作大鼠脊髓挫伤动物模型，损伤后立即进行药物干预，实验动物分组：RADAmix组，RADAmix-Taxol组，对照组(5%葡萄糖)，每组10只老鼠共30只老鼠，术后8周后取材，进行免疫荧光染色和HE染色，经组织学分析，比较各组损伤区域神经丝蛋白NF200表达情况，脱髓鞘情况，炎症反应程度，脊髓损伤处空腔形成情况。同时采用BBB评分观察各组大鼠下肢运动功能恢复情况。
　　结果：原子力显微镜观察 RADAmix-Taxol经触发后的微观结构，结果显示RADAmix-Taxol可经DMEM/F12触自组装后可形成纳米纤维结构；体外培养大鼠神经元细胞，各组药物干预后进行神经元突起长度比较后发现，低浓度紫杉醇（5nM）可促进神经元轴突生长；Nocodazole可以抵消紫杉醇的促进轴突生长作用；与对照组相比，RADAmix与Taxol联合使用单用RADAmix可更好的促进神经元轴突；术后8周，HE染色RADAmix-Taxol组脊髓损伤处的空洞面积较其他组显著减小，组织学分析显示RADAmix-Taxol组比其他组脊髓损伤中心区域脱髓鞘程度最小，轴突更多，炎症反应程度也较其他组小。 BBB评分结果比对照组均有明显增高(P<0.05)。
　　结论：成功构建RADAmix-Taxol缓释体系，且能够实现对紫杉醇的释放调控；紫杉醇可通过微管稳定作用促进神经元轴突生长，RADAmix不影响紫杉醇活性，且RADAmix与紫杉醇协同作用促进神经元轴突延伸；RADAmix-Taxol能减小大鼠脊髓损伤后空洞，促进损伤区域神经元轴突再生，抑制脱髓鞘病变，促进脊髓损伤运动功能恢复，减轻炎症反应且RADAmix与大鼠脊髓组织相容性好。因此自组装多肽缓释体RADAmix-Taxol可作为一种新的治疗方法治疗脊髓损伤。

目录

声明

前言

第一部分 材料与方法

1.1 实验仪器：

1.2主要实验试剂：

1.3实验动物

2. 实验方法

2.1 试剂配制

2.2多肽合成、纯化、分析：

2.3 多肽分子自组装及缓释体系构建：

2.4 RADAmix-Taxol体外药物释放试验

2.5 自组装多肽缓释体系原子力显微镜下微观结构观察

2.6 神经元细胞体外培养

2.7 体外实验药物干预分组

2.8 神经元细胞免疫荧光染色及各组神经元突起长度测量

2.9 大鼠脊髓损伤动物模型制备

2.10 实验动物分组

2.11 脊髓药物注射

2.12 组织学评价：

3统计学处理

第二部分 结果

1. RADA16及RADA-FGL合成、纯化和分析

2. 神经元细胞的获得、培养与鉴定

3. 不同条件干预下神经元轴突生长情况

4. 不同组缓释体体外紫杉醇释放试验

5. 多肽自组装及其理化特性检测

6. 成功建立大鼠脊髓损伤模型

7. RADAmix-Taxol抑制脊髓空洞形成

8. RADAmix-Taxol抑制脱髓鞘

9. RADAmix-Taxol损伤区域轴突再生

10. RADAmix-Taxol减轻损伤区域炎症反应

11.后肢运动功能评分（BBB评分）

第三部分 讨论与小结

讨论

小结

参考文献

综述：脊髓损伤治疗研究进展

研究生期间发表论文

致谢