病毒样颗粒包装锌指核酶形成假病毒及其对HPV16阳性细胞的杀伤研究

摘要

目的：
　　1.前期工作中已经通过分析HPV16中癌基因E7的序列信息，并以此为基础构建靶向于不同靶点的锌指核酶质粒，利用体外的报告体系初步筛选出切割效率最好而毒副作用最小的ZFNs对，同时通过对ZFN的切割域和骨架系统进行优化，筛选出切割效率最高的ZFN对，此项工作已经在前期完成。
　　2.建立VLPs假病毒感染细胞的阳性体系。通过应用HPV16的VLPs包装PrwB红光质粒，得到VLP-PrwB的假病毒。产生的假病毒进行收获及纯化，纯化后的产物分别转染各个细胞系，通过红光的观察来验证VLPs-PrwB假病毒的感染效率。包装纯化后的VLPs-PrwB可以作为后期包装的阳性对照。
　　3.将ZFN目的片段取代PrwB的红光序列，构建到PrwB载体上，形成的质粒用VLPs进行包装，包装后的产物进行收获以及纯化，然后纯化产物对不同细胞进行感染，验证ZFNs对HPV16 E7的切割效果。
　　方法：
　　1.前期实验中已得切割效率最好而毒副作用最小的ZFN对ZFN-L和ZFN-R。
　　2.构建VLPs包装的阳性质粒：用p16L1L21质粒和PrwB质粒共转染包装工具细胞293FT。转染的p16L1L2质粒在293FT中表达出L1和L2蛋白，并且组装成HPV16的衣壳。衣壳组装过程中，将目的质粒PrwB包装进入衣壳中形成VLP-PrwB假病毒。包装好的VLP-PrwB假病毒进行收集及纯化。纯化后的VLP-PrwB假病毒感染293细胞确定感染的有效滴度。确定滴度后的 VLP-PrwB假病毒感染 SiHa， HeLa，C33-a和293等细胞后，观察其中红光的发光效率的方法确定其感染效率。
　　3.通过对之前验证针对 HPV16 E7有效的锌指核酶目的片段进行扩增，连接构建到PrwB的骨架载体上，分别命名为ZFN-L和ZFN-R。
　　4.构建VLPs包装ZFN-L和ZFN-R：用p16L1L2质粒和ZFN-L和ZFN-R质粒共转染包装工具细胞293FT。p16L1L2质粒在293FT中表达出L1和L2蛋白包装ZFN-L和ZFN-R质粒形成VLP-ZFN-L和VLP-ZFN-R假病毒。包装好的VLP-ZFN-L和VLP-ZFN-R假病毒进行收集及纯化。纯化后的 VLP-ZFN-L和 VLP-ZFN-R假病毒对SiHa，HeLa以及C33-a细胞进行感染。（1）T7E1实验检测经VLP-ZFN-L和VLP-ZFN-R假病毒共同感染的细胞系中DNA是否存在有DNA被切割形成双链断裂（double strandes break，DSB）并导致同源重组（homologous recombination， HR）以及非同源性末端连接（Non-homologous end joining， NHEJ）。（2）细胞凋亡可以显示VLP-ZFN-L和VLP-ZFN-R假病毒共同感染细胞之后，细胞的凋亡情况。（3）克隆形成实验可以通过VLP-ZFN-L和VLP-ZFN-R假病毒感染细胞之后，通过对细胞进行消化以及种植到孔板后，观察细胞克隆的形成个数从而得到假病毒对细胞的增殖能力的影响。（4）western blotting检测VLP-ZFN-L和VLP-ZFN-R假病毒感染细胞之后细胞中HPV16的E6，E7蛋白以及和E7相互作用的pRb蛋白的表达。
　　结果：
　　1.利用VLPs包装的PrwB质粒形成的VLP-PrwB假病毒，经过收获以及纯化之后，能使得感染的细胞发红光。说明VLPs包装PrwB质粒形成的VLP-PrwB假病毒能够感染细胞，并且其中包装的质粒可以在宿主细胞内进行表达。成功建立VLPs包装质粒形成假病毒的体系，以及作为包装其他质粒形成假病毒的阳性对照。
　　2. VLP-ZFN-L和VLP-ZFN-R假病毒一起感染SiHa，HeLa和C33-a，其中的ZFN质粒能够进入细胞内表达出相应蛋白，形成锌指核酶的识别序列以及切割序列，有效的切割DNA靶序列，从而引起：（1）HPV16 E7的序列形成DSB，继而激活细胞内DNA的修复机制，从而导致HR以及NHEJ。这种效果在HeLa和C33-a中并没有出现，说明锌指核酶切割的特异性。（2）VLP-ZFNs感染导致SiHa细胞的凋亡增加，但是HeLa和C33-a中并没有出现明显的凋亡。（3）VLP-ZFNs感染细胞之后，SiHa细胞的克隆形成明显减少，但是对HeLa和C33-a的克隆形成的影响并不大。（4）western blotting检测HPV16的E6，E7及相关蛋白时候发现，假病毒感染的SiHa细胞E7蛋白量表达下降，pRb蛋白表达量上升，而HeLa和C33-a的变化不大。
　　讨论：
　　1.综上所述，通过对VLP-PrwB假病毒进行包装，证实VLP可以携带目的质粒形成假病毒。这种假病毒可以感染目的细胞，并使目的基因在靶细胞进行表达。证明了VLP包装形成假病毒的可行性以及该体系的建立，为后期的实验建立了阳性对照。
　　2.通过VLP包装ZFNs形成VLP-ZFNs假病毒，这种假病毒可以感染SiHa细胞，并且其中的ZFNs可以在细胞内表达，ZFNs表达形成的蛋白可以针对特定序列进行切割，本实验中设计的ZFNs针对HPV病毒的E7序列，从而导致HPV E7序列被切割，继而SiHa细胞凋亡。VLP包装锌指核酶，可以提供一种让目的基因进入细胞内的方式，本实验结果，为以后VLP包装形成假病毒，提供了较好的实验基础。

目录

声明

华中科技大学博士学位论文创新点概述

英文缩略词表

研究背景

HPV 主要结构及各相关蛋白的机能

HPV 的生活周期及其致癌机制

HPV16的VLPs的应用进展

锌指核酶（Zinc Finger Nuclease，ZFN）

用HPV16的VLP包装锌指核酶形成VLP-ZFNs假病毒

参考文献

第一部分 VLP-PrwB假病毒的包装，纯化以及感染效果验证

1.前言

2.材料和方法

3.结果

4.讨论

参考文献

第二部分 VLP包装ZFNs形成VLP-ZFNs假病毒，以及假病毒对HPV16阳性宫颈癌细胞的杀伤研究

1.前言

2.材料和方法

3.结果

讨论

参考文献

附件1. PrwB-ZFN-L以及PrwB-ZFN-R测序结果

综述

致谢