酮体生成/SIRT3介导绿茶多酚对高脂膳食大鼠肾脏保护作用的机制初探

摘要

本文从以下几个部分展开论述：
　　第一部分 绿茶多酚对高脂膳食大鼠肾脏氧化应激水平和肾功能的影响
　　目的：氧化应激在高脂膳食引起的肾脏结构和功能受损中扮演重要角色，而植物化学物可以通过多种途径降低机体氧化损伤。本部分将主要观察绿茶多酚对高脂膳食大鼠肾脏氧化应激水平及肾脏结构和功能的影响。
　　方法：体重160-180克雄性Wistar大鼠60只，适应性喂养一周后分为6组每组10只，对照组（CON）自由摄食标准饲料；对照+绿茶多酚组（CON+GTPs）自由摄食添加了绿茶多酚（200mg/kg.bw）的标准饲料；高脂膳食组（HFD）自由摄食高脂饲料；高脂+绿茶多酚干预组(HFD+GTPs)自由摄食添加了绿茶多酚（200mg/kg.bw）的高脂饲料；限食组（CR）摄食量为对照组摄食量70％；限食+绿茶多酚组（CR+GTPs）：在限食组饲料的基础上添加绿茶多酚（200mg/kg.bw）。实验第16周，大鼠分别禁食12小时和6小时后，进行腹腔注射葡萄糖耐量实验和胰岛素耐量实验；第17和18周利用代谢笼收集全部大鼠尿液；18周末将全部大鼠处死，收集血液、肾脏、肝脏及肾周睾周脂肪。计算内脏脂肪系数和肾脏系数；采用试剂盒测定血生化指标、尿液肾功能指标、抗氧化物酶活性及氧化损伤指标；制作肝脏、肾脏冰冻切片进行油红O染色；制作石蜡切片进行HE染色及4-羟基壬烯醛进行免疫组化染色。
　　结果：1）虽然总能量摄入与对照组无明显差别，但是HFD组大鼠体重及内脏脂肪系数显著增加；HFD+GTPs组大鼠体重及内脏系数显著降低。2）GTPs干预能改善高脂膳食引起的血清总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇的增加，以及高密度脂蛋白胆固醇的降低；GTPs干预能降低限食组大鼠血清总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇，升高高密度脂蛋白胆固醇。3）HFD组大鼠葡萄糖耐量曲线下面积最大，GTPs干预高脂组面积减少，CR组大鼠葡萄糖耐量曲线下面积最小，但差异无统计学意义，CR+GTPs组面积略有上升；胰岛素耐量实验中HFD组大鼠60min时间点血糖值较高，GTPs干预高脂膳食组降低，CR组30min时间点血糖值最低；HFD组大鼠血清胰岛素水平较高，绿茶多酚干预高脂组有所下降，但差异无统计学意义，CR组与对照组差异无统计学意义。4）GTPs干预能降低HFD摄入引起的肾脏4-HNE和MDA水平的增高；限食组与对照组间4-HNE和MDA差异无统计学意义。5）HFD组大鼠MnSOD、Cu/ZnSOD、总SOD及Catalase活性均降低，HFD+GTPs组及CR组抗氧化酶活性增加。6）HFD组大鼠尿微量白蛋白与肌酐比值、尿NAG酶活性以及血清胱抑素C较对照组有所升高，GTPs干预能改善高脂膳食引起的肾功能异常；CR组大鼠尿NAG酶活性较低，内生肌酐清除率较高。7）HE染色显示各组大鼠肾脏无明显病理性改变；油红O染色显示高脂膳食大鼠肝脏脂滴沉积较多，肾脏无明显改变。
　　结论：在本实验条件下，高脂膳食摄入能诱导大鼠出现血脂代谢紊乱，肾脏氧化应激水平升高，导致肾功能受损，而绿茶多酚干预可以改善高脂膳食大鼠肾功能，可能与调节血脂代谢，降低肾脏氧化应激水平有关。
　　第二部分 绿茶多酚对高脂膳食大鼠肾脏生酮能力的影响及抗氧化机制
　　目的:酮体和绿茶多酚均有保护肾脏缓解氧化损伤的作用，我们前期的研究显示高脂膳食能降低大鼠肾脏生酮关键酶的表达，绿茶多酚干预则能逆转这一改变，因此本部分旨在观察绿茶多酚能否通过促进肾脏生酮作用，保护高脂膳食大鼠肾脏减少氧化损伤。
　　方法:动物饲养与第一部分相同；利用试剂盒检测大鼠肾皮质及血清中β-羟丁酸的浓度，以及肾皮质总NAD水平；采用Western blot方法检测肾皮质HMGCS2、SIRT3、Nampt、FOXO3a、MnSOD、乙酰化-MnSOD及Catalase的蛋白表达水平。
　　结果:高脂膳食能上调大鼠血清β-羟丁酸浓度，降低肾皮质β-羟丁酸浓度及SIRT3、Nampt蛋白表达水平，绿茶多酚干预能上调高脂膳食组大鼠皮质β-羟丁酸浓度及生酮关键酶HMGCS2、SIRT3和Nampt蛋白表达水平，降低MnSOD乙酰化水平；限食能上调大鼠血清及肾皮质β-羟丁酸浓度及生酮关键酶HMGCS2、SIRT3和Nampt蛋白表达水平，降低MnSOD乙酰化水平。
　　结论:在本实验条件下，与限食干预效果类似，绿茶多酚干预能上调高脂膳食大鼠肾脏生酮能力和SIRT3表达及活性，进而提高MnSOD的抗氧化活性。
　　第三部分生酮抗氧化作用的体外实验研究
　　目的：前两部分已证实绿茶多酚能够升高高脂膳食大鼠肾脏生酮关键酶的表达及酮体浓度，降低肾脏氧化应激水平，因此本部分将在体外验证生酮的抗氧化效果及其作用机制。
　　方法:采用高糖培养基培养人胚肾HEK293细胞，待细胞生长密度达到60-70%时，更换为优化培养基，使用lipo3000进行HMGCS2真核表达质粒转染，24h后施加干预物；绿茶多酚（GTPs，4μg/ml）、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG，4μg/ml)、表没食子儿茶素（EGC，4μg/ml）和β-羟丁酸（0.5mM、5mM、25mM）分别作用24小时，H2O2(0.1mM)作用6小时。利用Western blot方法检测4-HNE、HMGCS2、SIRT3、乙酰化-MnSOD、MnSOD及Nampt蛋白表达水平。
　　结果:GTPs、EGCG及EGC均能上调转染HEK293细胞HMGCS2蛋白表达，但对Nampt表达无影响；GTPs和EGCG可以上调细胞SIRT3表达；HMGCS2转染虽然对SIRT3表达无影响，却可以降低MnSOD（K122）乙酰化水平；转染HMGCS2可以降低H2O2干预下HEK293细胞4-羟基壬烯醛（4-HNE）水平；β-羟丁酸能下调HMGCS2表达。
　　结论:在本实验条件下，转染HMGCS2可以通过上调HEK293细胞SIRT3活性，降低氧化损伤；酮体生成/SIRT3途径可以介导茶多酚的抗氧化保护作用。

目录

声明

英文缩写词汇表

前言

第一部分 绿茶多酚对高脂膳食大鼠肾脏氧化应激水平和肾功能的影响

前言

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4结论

第二部分 绿茶多酚对高脂膳食大鼠肾脏生酮能力的影响及抗氧化机制

前言

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4结论

前言

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4结论

小结与展望

小结

创新点

局限性

后续研究

参考文献

综述：酮体对健康的保护作用

附录博士研究生期间的工作小结（2014～2017年）

致谢