SDF-1α/CXCR4信号轴在软骨下骨骨重塑和软骨退变中的作用及其机制研究

摘要

目的：
　　1.探讨外源性SDF-1α对体外骨髓间充质干细胞(MSCs)和软骨细胞软骨分化和成熟的影响，并探索其机制。
　　2.观察SDF-1α阻断剂AMD3100对创伤后骨关节炎模型小鼠的骨关节炎病理改变的影响，并探讨SDF-1α/CXCR4信号轴在软骨下骨改变和软骨退变的作用机制。
　　方法：
　　1.使用取材的骨髓间充质干细胞在软骨诱导培养基条件下诱导其向软骨细胞分化，并验证CXCR4在MSCs中的表达。此外对MSCs给予SDF-1α处理（浓度为50ng/mL和100ng/mL），通过碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）染色、阿利新蓝（Alcian blue）染色和Western blot测定软骨分化相关蛋白等方法检测SDF-1α对软骨细胞的分化成熟的影响，同时使用原代软骨细胞进行进一步验证。
　　2.取8周龄C57/BL6雄鼠实施前交叉韧带横断（ACLT）手术构建创伤后骨关节炎（PTOA）小鼠模型，并使用假手术组做对照。将PBS或AMD3100持续泵入小鼠皮下，并在ACLT或假手术后30天处死小鼠。通过微计算机断层扫描（μCT）对胫骨软骨下骨进行定量分析。通过组织切片染色分析膝关节软骨退变和软骨下骨的改变。使用ELISA试剂盒定量检测SDF-1α和胶原I型c-端肽片段（CTX-1）的血清水平。使用骨髓单核细胞（BMMC）来阐明SDF-1α对破骨细胞形成的影响。使用蛋白免疫印迹和PCR检测破骨细胞分化和通路相关蛋白和基因的表达。
　　结果：
　　1.通过体外实验，我们发现SDF-1α在软骨分化诱导培养条件下促进MSCs软骨成熟蛋白CollagenX和MMP-13的表达，但对软骨分化早期指标Collagen II和 Aggrecan的表达以及软骨基质形成没有影响，在原代软骨细胞中也得到类似的结果。同时我们检测到SDF-1α可以促进MSCs中Wnt/β-catenin通路的激活；抑制Wnt/β-catenin之后，发现SDF-1α对MSCs软骨分化作用消失。
　　2.μCT分析显示ACLT造模可引起小鼠胫骨软骨下骨的骨小梁显着丢失， AMD3100可以抑制这种软骨下骨的改变并延缓关节软骨退变。血清生物标志物检测显示SDF-1α水平增高和骨吸收增强，AMD3100也抵消这些变化。细胞和分子水平实验结果显示SDF-1α通过激活MAPK途径（包括ERK和p38，但不包含JNK）促进破骨细胞的形成，并且促进抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP，组织蛋白酶K（CK）和基质金属蛋白酶（MMP）-9在破骨细胞中的表达。
　　结论：
　　1.我们的研究结果表明SDF-1α具有促进软骨成熟和向膨胀软骨转化的作用，并揭示这种作用是通过激活Wnt/β-catenin通路介导的。
　　2.我们的研究还表明SDF-1α通过激活MAPK途径促进破骨细胞的分化，阻断SDF-1α在体外和体内均抑制破骨细胞形成。AMD3100能够预防PTOA小鼠中的骨小梁丢失从而减弱延缓关节退变。这些结果揭示 AMD3100可能是PTOA的潜在治疗方法。

目录

声明

华中科技大学博士学位论文创新点概述

前言

参考文献

第一部分 SDF-1α/CXCR4信号轴对骨髓间充质干细胞和原代软骨细胞的软骨形成的影响及其机制的研究

前言

材料与方法

一．实验材料

二．实验方法

结果

1. 取材的大鼠MSCs具有良好的三系分化潜能

2. CXCR4在大鼠 MSCs上的表达

3. SDF-1α对MSCs软骨形成的无明显影响

4. SDF-1α对MSCs软骨形成的无明显影响

5. SDF-1α对MSCs软骨分化过程中软骨表型的影响

6. SDF-1α对原代软骨细胞分化过程中软骨表型的影响

7. SDF-1α对MSCs分化过程中WNT/β-catenin通路的影响

8. 阻断Wnt/β-catenin通路可以减弱SDF-1α对MSCs软骨成熟的影响

讨论

参考文献

第二部分 阻断软骨下骨中SDF-1α/CXCR4轴缓解创伤后骨关节炎

前言

材料与方法

一．实验材料

二．实验方法

结果

1. 通过μCT成像对胫骨软骨下骨进行分析

2. 软骨下骨中CXCR4表达增多和骨吸收活性增强

3. 抑制软骨下骨中SDF-1α/CXCR4信号传导可减弱软骨退化

4. SDF-1α和CTX-I浓度的测定

5. SDF-1α/CXCR4信号对体外破骨细胞分化的影响

6. SDF-1α/CXCR4信号对体外破骨细胞相关分子的影响

7. SDF-1α/CXCR4信号对BMMC中MAPK通路的影响

讨论

参考文献

综述：骨关节炎中软骨下骨变化对关节软骨退变的影响

附录一 英文缩写词表

附录二 攻读博士学位期间发表的论文以及参与的课题

致谢