miR-330-3p调控GRIA3/MAPK/ERK通路在非小细胞肺癌脑转移发生中的作用

摘要

第一部分：过表达和靶向沉默miR-330-3p非小细胞肺癌稳转细胞系对非小细胞肺癌及脐静脉内皮细胞表观功能及裸鼠皮下移植瘤和脑转移模型的影响
　　目的：体内外研究探讨调节miR-330-3p对非小细胞肺癌细胞增殖、侵袭等功能的影响。
　　方法：（1）Real-time PCR（qRT-PCR）检测支气管肺正常细胞系（Beas-2B）、非小细胞肺癌细胞（NSCLC）及初诊为非小细胞肺癌患者伴或不伴脑转移肿瘤组织中miR-330-3p的表达；（2）构建稳定过表达和靶向沉默miR-330-3p的非小细胞肺癌细胞系：靶向沉默miR-330-3p的慢病毒载体，过表达miR-330-3p的慢病毒载体，阴性对照慢病毒空载体，通过病毒感染的方法分别导入A549和HCC827中，利用嘌呤霉素（puromycin）筛选获得稳定细胞株；(3)Real-time PCR（qRT-PCR）及免疫荧光验证慢病毒转染效率；（4）MTT检测各组稳转细胞系的增殖能力；（5）流式细胞术周期实验及凋亡实验检测各组稳转细胞的增殖及凋亡（6）Western Blot方法检测各组稳转细胞株周期相关蛋白cyclinD1及凋亡相关蛋白BAX，bcl-2表达的变化；（7）划痕实验、小管形成实验、Transwell小室迁移及侵袭实验观察各组细胞迁移、侵袭及成管能力的变化；（8）将各组稳转细胞系连续培养48h后取细胞上清，离心后将上清与人脐静脉内皮细胞HUVECs共培养，利用划痕实验、小管形成实验、Transwell小室侵袭实验及Western Blot方法检测干扰miR-330-3p后对内皮细胞迁移、成管及侵袭能力的影响；（9）将各组稳转细胞系接种于裸鼠右前臂构建裸鼠皮下移植瘤模型，绘制瘤体体积生长曲线及生存曲线，观察各组裸鼠瘤体体积的变化；活体成像技术检测瘤体荧光信号强度的变化；（10）采用小鼠脑立体点位技术，将各组稳转细胞系注射于裸鼠颅内构建裸鼠脑转移模型，观察干扰miR-330-3p后对瘤体转移能力的变化。
　　结果：（1）miR-330-3p在NSCLC中的表达高于正常肺上皮细胞；miR-330-3p在非小细胞肺癌合并脑转移的患者中表达高于无脑转移的患者；（2）成功构建稳定过表达及沉默miR-330-3p和感染阴性对照病毒的A549、HCC827非小细胞肺癌细胞株。实验分为4组：①空白对照组（NC）：未转染慢病毒的正常A549、HCC827细胞；②阴性对照组（NC-LV）：转染阴性对照病毒的A549、HCC827细胞；③沉默miR-330-3p组（anti-miR-330-3p-LV）：转染沉默miR-330-3p病毒的HCC827和A549细胞；④过表达miR-330-3p组（OE-miR-330-3p-LV）：感染过表达miR-330-3p慢病毒的A549、HCC827细胞。（3） MTT实验显示OE-miR-330-3p-LV组细胞在24h及48h增殖能力较对照组升高， anti-miR-330-3p-LV组细胞增殖能力较对照组降低，且差异具有统计学意义；（4）流式细胞学周期试验显示OE-miR-330-3p-LV组细胞可使细胞周期阻滞在S期，凋亡实验显示OE-miR-330-3p-LV组细胞较对照组凋亡减少，anti-miR-330-3p-LV组细胞较对照组凋亡增加；（5） Western blot检测显示OE-miR-330-3p-LV组cyclinD1表达水平升高，anti-miR-330-3p-LV组细胞表达水平减低；凋亡相关蛋白BAX在OE-miR-330-3p-LV组表达明显减少，在anti-miR-330-3p-LV组表达明显增加。抗凋亡蛋白 Bcl-2在 OE-miR-330-3p-LV组表达明显升高，在anti-miR-330-3p-LV组表达明显减低；（6）划痕实验、Transwell迁移及侵袭实验显示， OE-miR-330-3p-LV组细胞迁移率及侵袭能力较 NC-LV组高， anti-miR-330-3p-LV组细胞迁移率及侵袭能力较NC-LV组低。（7）HUVECs细胞与各组稳转细胞上清共培养实验显示，OE-miR-330-3p-LV组细胞上清可使HUVECs细胞迁移及侵袭增强，anti-miR-330-3p-LV组细胞上清使HUVECs细胞迁移率及侵袭能力降低；成管实验显示OE-miR-330-3p-LV组细胞上清可使HUVECs细胞形成致密，完整的管状结构，anti-miR-330-3p-LV组细胞上清使HUVECs细胞形成疏松、不完整的管状结构。（8）裸鼠皮下移植瘤模型表明，接种了OE-miR-330-3p-LV组细胞的裸鼠瘤体生长较快，体积较对照组大，接种了anti-miR-330-3p-LV组细胞的裸鼠瘤体生长较慢，体积较对照组稍小。连续观察4周后发现，接种了OE-miR-330-3p-LV组细胞的裸鼠生存时间缩短。（9）裸鼠脑转移模型显示，颅内注射OE-miR-330-3p-LV组细胞的裸鼠脑转移瘤可侵及整个大脑，颅内注射anti-miR-330-3p-LV组细胞的裸鼠脑转移瘤局限或无法形成转移瘤。
　　结论：过表达miR-330-3p可促进非小细胞肺癌细胞的迁移、侵袭、成管及增殖能力，抑制细胞凋亡；沉默miR-330-3p可抑制非小细胞肺癌细胞的迁移、侵袭、成管及增殖能力，促使细胞凋亡。
　　第二部分：miR-330-3p以GRIA3为靶基因通过激活MAPK/ERK信号通路发挥生物学作用
　　目的：探究miR-330-3p在非小细胞肺癌细胞系中发挥生物学作用的靶基因及具体相关机制。
　　方法：（1）利用生物信息学技术即靶基因预测网站（TargetScan, PicTar, HOCTar, Tarbase, miRanda and microCosm），进一步结合全基因分析，选取预测的靶基因；利用荧光素酶报告基因的方法验证miR-330-3p的靶基因；（2）qTR-PCR及Western Blot方法在各组稳转细胞系中检测靶基因的表达情况；（3）qTR-PCR检测非小细胞肺癌伴或不伴脑转移患者的血清中靶基因GRIA3的表达情况；（4）将过表达GRIA3的质粒转染入A549及HCC827细胞中，通过Western Blot方法验证转染效率；MTT实验、划痕实验、transwell迁移实验检测过表达GRIA3后细胞的增殖迁、移能力；（5）将过表达miR-330-3p的A549细胞及NC-LV细胞利用基因芯片技术，得出通路富集图，通过Western Blot方法验证相关通路；（6）在各组稳转细胞系中加入通路抑制剂，观察抑制剂对GRIA3的影响。
　　结果：（1）综合靶基因预测网站分析的miR-330-3p的靶基因及基因组分析技术分析得出的靶基因，初步得出miR-330-3p的靶基因GRIA3。利用荧光素酶报告基因的方法验证得出GRIA3可作为miR-330-3p的靶基因。（2）qTR-PCR及Western Blot方法显示，GRIA3与miR-330-3p是负调控关系，即在OE-miR-330-3p组细胞中GRIA3表达水平降低，在anti-miR-330-3p-LV组细胞中GRIA3表达水平升高，且具有统计学意义（p<0.05）。（3）qTR-PCR技术显示GRIA3在脑转移组（BM+）组较无脑转移组（BM-）表达水平减低；（4）过表达GRIA3的A549及HCC827细胞增殖能力较对照组减低；过表达GRIA3的A549及HCC827细胞迁移率较对照组降低，差异具有统计学差异（p<0.05）。（5）Western Blot显示anti-miR-330-3p-LV组细胞p-ERK1/2、p-AKT蛋白表达水平升高；分别加入MAPK/ERK、PI3K/AKT通路抑制剂后，GRIA3表达水平在加入MAPK/ERK通路抑制剂后升高，且在加入抑制剂组A549及HCC827迁移能力降低，表明miR-330-3p可能通过MAPK/ERK通路发挥生物学作用。
　　结论：miR-330-3p可能以GRIA3为靶基因通过激活MAPK/ERK通路发挥生物学功能。

目录

声明

英文缩略词

第一部分：过表达和沉默miR-330-3p非小细胞肺癌稳转细胞系对非小细胞肺癌及脐静脉内皮细胞表观功能及裸鼠皮下移植瘤和脑转移模型的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分：miR-330-3p以GRIA3为靶基因通过激活MAPK/ERK信号通路发挥生物学作用

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

结论

综述:microRNAs与脑转移：诊断和治疗的潜在靶点

致谢