微生物混合菌群促进粗甘油生物转化同步产氢产乙醇工艺

摘要

随着世界能源需求的持续增长，用可再生能源替代正在快速消耗的化石能源日益迫切。因此，包括氢气、生物乙醇、生物柴油在内的生物能源正在变得更加重要。作为一种可再生、无污染的能源方式，生物能源势必对未来能源结构调整产生重要贡献。最近几年生物柴油生产量已经呈现指数增长，与此同时，生产工艺伴随产生大量的甘油副产品，相关学者指出这些粗甘油是一种品质适宜、量大、低廉的发酵原材料。到目前为止，许多研究致力于采用纯菌（或者不典型的混合菌群）转化纯甘油，但是由于抑制化合物的存在往往导致在对粗甘油转化试验时获得的发酵效能比较低。因此，本研究采用一种新的方式直接针对生物柴油伴生的粗甘油进行筛选培育专性混合功能菌群并进行实际应用优化研究。
　　通过多次小型序批式转接优化可以实现从污泥中富集目标菌，这种方式仅需要一个基本的培养基（不需要额外的营养条件）就能够仅仅依靠粗甘油为唯一碳源进行培养。通过16S rDNA克隆文库分析，富集培养后的微生物群落中有58％的菌群属于Klebsiella菌属，32%属于Escherichia菌属。这些主要优势菌群均具备甘油发酵能力，能够产生氢气和乙醇。除此之外，所富集功能菌群的少数菌属于Cupriavidus菌属占10%，这类菌不能直接利用甘油代谢，但是它们的功能是转化甲醇。甲醇是粗甘油中最典型的杂质成分，甲醇的存在会造成其他发酵菌的生长和代谢抑制。因此，本研究采用的富集方法所获得的功能菌群可以实现高效的甘油转化产生氢气和乙醇，同时发挥稳定的优势发酵功能，这为后续的优化调控提供研究条件。
　　研究在125 mL序批发酵静态优化试验中，所富集的目标功能菌群能够有效的将甘油转化为氢气和乙醇，转化率均能够接近理论计量产率。在37℃，初始pH值为7.9，甘油进料浓度为15.0 g/L条件下，最高氢气产率达到0.96mol H2/mol glycerolconsumed，最大产氢速率为2191 mL H2/L/d。乙醇转化率达到1 mol EtOH/mol glycerolconsumed，产物含量约为8 g/L，甘油的转化率高达98%。总能量转化效率达到98.25%，其中产物中乙醇贡献82%、氢气贡献16.25%。研究结果表明这种甘油发酵同步获得乙醇和氢气的方式优势十分巨大。基于此，将该试验设计应用于构建稳定的混合功能菌群的高效甘油发酵转化工艺是具备可行性的，能够实现同步乙醇和氢气的最大转化。此外，超过50%的甘油到乙醇的转化能力意味着乙醇为主要发酵产物的潜力。
　　本研究结果获得的粗甘油产品转化率达到了同期文献中报道的最好水平，但是报道中采用的是纯甘油序批式试验所获得的实际运行效果与理论值相当。本研究能够较早报道的完全以乙醇和氢气为共同产品的最大收益研究。试验表明采用富集的高效功能菌群和优化试验设计是一个能够获得高效转化粗甘油获得生物能源的有效方法，该方法不需要外加维生素、矿物元素或者蛋白胨、酵母浸粉等复杂的培养条件。在此优势基础上，放大试验在一个3L的生物反应器（工作条件1 L）中进行，静态模型获得进一步检验，通过优化进一步提高目标产物产量。对模型的预测获得很好的结果：通过 Box-Behnken优化模型设计计算获得不同预测值仅比实际获得结果在氢气产率上高出6.5%、乙醇产率高出2.3%，因此，研究表明该静态预测试验过程可以用于放大试验的预测分析。
　　通过不同类型甘油的对比试验（纯甘油、两种粗甘油，分别都在灭菌和不灭菌两种条件），分析结果表明在该工艺模型中产品转化率不会随着不同底物性质而产生产品差异。氢气产生速率基本稳定在2.96 L/L/d±185，氢气转化率为0.9 mol H2/molglycerolconsumed。平均氢气积累量达到3.62 L/L/d±199，氢气含量为54%±0.99。通过修正的Gompertz方程对动力学特征解析与试验数据一致，这表明采用富集混合功能菌群处置复杂底物的可行性。事实上，本研究与很多已发表的研究文章结果不同之处在于与纯甘油相比没有效能的损耗，但是最大的氢气产率同样是在对进料底物不灭菌条件下获得。此外，底物降解效率在扩大试验条件下有所降低，平均转化率达到97.42%±0.98，所有发酵产物的碳平衡率为88%。
　　在进料速率为20g/L粗甘油时，未添加任何额外营养元素并不需要灭菌条件下进料，序批式试验获得的乙醇浓度增加了3倍，达到26 g/L，平均产率达到0.4 gEtOH/gglycerol consumed；氢气产量达到9L，平均氢气产率为0.14 L H2/gglycerol consumed。甘油底物降解率达到65.3 g/L（相当于95 g/L粗甘油进料）。在超过380小时的运行时间内工艺整体底物转化率接近87.4%。乙醇为最主要的发酵产物，占到所有代谢产物的81%。基于上述研究，采用一个技术经济成本核算对可以应用的工业运行规模进行估算，对于一个可以达到28 MWth的工厂，理论停留时间为120 h达到26g/L乙醇产量条件，氢气和乙醇共同贡献的能量成本为0.019€/kWhth和0.057€/kWhel。不考虑可能的氢气收益，生物乙醇成本为0.21€/L。这些结果意味着所开发的工艺能够实现经济上盈利，体现了未来较好的应用前景。为了使该技术更加贴近市场调节，后续研究主要针对未来实验室和放大试验的实际具体目标进行了深入分析。
　　考虑到实际甘油发酵过程条件下很难排除其他营养成分的介入，采用所富集的功能菌群针对结合农业和畜牧业产生的有机废弃物进行共发酵进行了进一步研究。研究采用了混料试验设计对甘油和共发酵基质（乳清干酪和牛肉浆）混合比例进行了优化试验，对氢气产量随底物混合比例的变化影响进行分析。通过条件优化，当底物为30%的牛肉浆和70%的乳清干酪混合条件下，混料试验设计达到最优（R2=0.962；p-value=0.0001；拟合率<0.05），最大氢气产率达到117 mL H2/g VSadded，相当于460 mL氢气，这与实际试验数据非常相符。尽管与乳清干酪相比，粗甘油属于品质不高的生物质底物，但是在混合共发酵过程中粗甘油转化率达到47%（乳清干酪为49%，牛肉浆为4%），氢气产率依然达到379mL以上。

目录

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中文摘要

英文摘要

A list of main acronyms usedin the dissertation

目录

CHAPTER1. INTRODUCTION

1.1 SUPPORTING FUNDINGAND PROJECTS

1.2 BIOFUELS

1.3 REVIEW ON CRUDE GLYCEROL

1.4 GLYCEROL CONVERSION TECHNOLOGIES

1.5 BIOREFINERY CONCEPT

1.6 QUESTIONS PROPOSED

1.7 RESEARCH CONTENTS AND TECHNOLOGY ROADMAP

CHAPTER2. MATERIAL AND METHODS

2.1 GLYCEROL FERMENTATION TESTS

2.2 ANALYTICAL METHODS

2.3 KINETIC ANALYSIS

2.4 MICROBIAL COMMUNITY STRUCTUREANALYSES

2.5 STATISTICAL ANALYSISMETHOD

CHAPTER3.SELECTION OF A STABLE FUNCTIONAL CONSORTIUM

3.1 INTRODUCTION

3.2 ENRICHMENT OF ACTIVATED SLUDGE

3.3 MICROBIAL COMMUNITY ANALYSIS

3.4 FURTHER CHARACTERIZATION OF THE GCL FUNCTIONAL CONSORTIUM

3.5 SUMMARY

CHAPTER4. OPTIMIZATION EXPERIMENTSFOR ENHANCEDHYDROGENAND ETHANOL PRODUCTION

4.1 INTRODUCTION

4.2 OPTIMIZATION OF OPERATIONAL PARAMETERS FOR H2 PRODUCTION

4.3 STATISTICAL OPTIMIZATIONFOR H2AND ETHANOL PRODUCTION

4.4ENERGY CONVERSION EFFICIENCY

4.5 SUMMARY

CHAPTER5. CO-FERMENTATION TESTSWITH DIFFERENT WASTE SUBSTRATES AND INOCULA

5.1 INTRODUCTION

5.2 CO-FERMENTATIONDESIGN

5.3MECHANISM AND EFFICIENCY OF CO-FERMENTATION

5.4 SUMMARY

CHAPTER6.SCALE-UP TESTS AND VIABILITY OF THE PROCESS

6.1 INTRODUCTION

6.2FEASIBILITY ANALYSISOF SCALE-UP

6.3POTENTIALANALYSIS FOR GLYCEROL BIOREFINERY

6.4 SUMMARY

CONCLUSIONS

NOVELTY OF THISSTUDY

FUTURE PLANS

参考文献

PAPERS PUBLISHEDDURINGTHE PERIOD OF PH.D. EDUCATION

声明

致谢

RESUME