99Tcm标记EGFR小分子靶向结合蛋白显像的实验研究

摘要

目的:制备99Tcm标记的表皮生长因子受体(epidermal growth factorreceptor, EGFR)小分子靶向结合蛋白ZEGFR∶1907分子探针，评价其体内外稳定性，分析该分子探针与细胞EGFR的体外靶向结合能力，研究分子探针在不同EGFR表达水平荷瘤裸鼠体内分布和体内显像，并进行相应对比分析，探讨其对EGFR高表达肿瘤早期、特异性诊断的可行性。
　　方法:采用Fmoc/tBu多肽固相合成法合成ZEGFR∶1907，于其N末端连接4个氨基酸[Gly-(D)Ala-Gly-Gly-]作为螯合剂，其可形成类似N4结构的强螯合基团，为了消除其分子基团间的空间阻碍，引入1个γ-氨基丁酸(4-aminobutyric acid， Aba)作为隔离物，得到化学结构为Gly-(D)Ala-Gly-Gly-Aba-ZEGFR∶1907的小分子靶向结合蛋白，再应用配体交换法进行核素99Tcm标记，最终制备形成99Tcm标记的EGFR小分子靶向结合蛋白ZEGFR∶1907分子探针（简写为99Tcm-ZEGFR∶1907）。采用反相高效液相色谱法（reverse-phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)测定其不同时间点的标记率及在生理盐水与人新鲜血清两种介质中37℃条件下孵育不同时间后的放化纯，以监测其体外稳定性。采用静置贴壁法在37℃恒温培养箱内培养EGFR高表达的人卵巢癌SKOV3细胞与EGFR低表达的人乳腺癌MDA-MB-435S细胞，取对数生长期的人卵巢癌SKOV3细胞用RPMI1640(Roswell Park Memorial Institute1640)培养液制成单细胞悬液，注射于每只BABL/c裸鼠的右前肢外侧皮下，每只裸鼠注射0.2ml，约1×107个细胞，SPF级(specific pathogen free，无特定病原体)环境下饲养，约4～5周肿瘤长至直径约1～1.5cm时，即建成EGFR高表达的人卵巢癌SKOV3细胞荷瘤裸鼠模型。此外，用同样的方法建立EGFR低表达的人乳腺癌MDA-MB-435S细胞荷瘤裸鼠模型。用RP-HPLC法测定SKOV3荷瘤裸鼠体内注射99Tcm-ZEGFR∶1907分子探针后2-3h内尿液中该分子探针的放化纯，监测其体内稳定性。进行EGFR高表达的人卵巢癌SKOV3与EGFR低表达的人乳腺癌MDA-MB-435S细胞两种肿瘤细胞对99Tcm-ZEGFR∶1907的体外摄取和滞留实验，分析EGFR与99Tcm-ZEGFR∶1907的体外靶向结合能力。另外，阻断实验中，在向SKOV3细胞中加入99Tcm-ZEGFR∶1907前20min先加入过量的未标记的ZEGFR∶1907进行阻断，研究EGFR与99Tcm-ZEGFR∶1907结合的体外靶向性。体内分布研究中取两种荷瘤裸鼠模型各16只，分别随机分成四组，每组4只，分别于尾静脉注射约37KBq/150ul分子探针99Tcm-ZEGFR∶1907后1、2、4、6h经眼静脉采血后，颈椎脱臼处死，即刻取出荷瘤裸鼠的心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、脑、骨骼、肌肉、肿瘤组织分别称重并测量其放射性计数，同时测量标准源的放射性计数，计算不同时刻每克组织的百分注射剂量率(percentage activityof injection dose per gram of tissue，％ID/g)及肿瘤/肌肉的(tumor to muscle，T/M)％ID/g比值。另取4只SKOV3荷瘤裸鼠在注射分子探针99Tcm-ZEGFR∶1907前2h先注射100倍过量未标记的ZEGFR∶1907进行阻断，4h后再进行体内分布研究。比较不同时间点及两种模型间分子探针99Tcm-ZEGFR∶1907在体内分布的差异，并分析阻断和非阻断处理所产生的差异。体内显像研究中取两种荷瘤裸鼠模型各5只，分别于尾静脉注射分子探针99Tcm-ZEGFR∶19070.1ml约37MBq(1mCi)后1、2、4、6、8、10h分别上机显像，为了研究分子探针体内显像特异性，另取人卵巢癌SKOV3细胞荷瘤裸鼠模型5只，在注射分子探针99Tcm-ZEGFR∶1907前2h先于尾静脉注射100倍过量的未标记的EGFR小分子靶向结合蛋白ZEGFR∶1907(500μg)进行阻断，然后再分别于注射分子探针后1、2、4、6、8、10h显像。观察荷瘤裸鼠肿瘤部位放射性浓聚的情况，对比观察阻断与非阻断处理所产生的差异，并用感兴趣区(ROI)技术计算不同时间点肿瘤部位与对侧同等位置、同等大小非肿瘤部位放射性计数的比值，即T/NT比值(target tonon-target ratio)，比较两种模型肿瘤部位放射性浓聚的差异。采用SAS9.1统计学软件对实验数据进行统计学分析，所有实验数据以均数±标准差表示，对数据进行两样本t检验（或t'检验）或Wilcoxon秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果:分子探针99Tcm-ZEGFR∶1907经HPLC测定放射峰呈单峰，保留时间约为23min，即刻标记率高，为96.485±1.42％。6h以内标记物的标记率仍＞95％，且保留时间固定，未见漂移。在生理盐水及人新鲜血清中37℃恒温孵育后，6h内分子探针标记率均＞90％，且保留时间均较固定，未见漂移。分子探针由尾静脉注入荷SKOV3细胞裸鼠体内后1小时取到裸鼠尿液，离心后取上清液于不同时间点用RP-HPLC测定放化纯，4小时内均在80％以上，尿液放射峰出现时间主要在约23min处，其前面约19min处出现一小代谢物峰，没有游离99TcmO4-出现。
　　人卵巢癌SKOV3细胞对99Tcm-ZEGFR∶1907的体外摄取率除1h(t=0.32,P=0.7573＞0.05)外，均高于人乳腺癌MDA-MB-435S细胞(t=3.28-24.05，t'=16.21，Z-2.80，均P＜0.05)，且在12h时达到最大值，为9.99％，之后略降低，但变化不大。各个时间点99Tcm-ZEGFR∶1907在SKOV3细胞中的滞留率均高于MDA-MB-435S细胞(t=18.38-39.85，均P＜0.0001)，且随时间延长滞留率下降减慢，并逐渐达到一个相对稳定的水平。阻断组SKOV3细胞在加入99Tcm-ZEGFR∶1907前20min加入过量的未标记的ZEGFR∶1907后，4h时的细胞摄取率从（5.52±0.43）％降到了(2.69±0.26)％，有显著性差异(t=13.67，P＜0.0001)。
　　荷瘤裸鼠体内分布结果表明99Tcm-ZEGFR∶1907在EGFR高表达SKOV3荷瘤裸鼠肿瘤组织内分布较高，其T/M比值由1h的（2.60±0.06）增长至6h的（7.05±0.14），肾脏中的放射性分布最高，其次为肝脏。此外，除肝脏和肾脏外，99Tcm-ZEGFR∶1907在大部分正常组织或器官中被快速清除。EGFR高表达SKOV3荷瘤裸鼠各时间点的T/M比值均高于EGFR低表达MDA-MB-435S荷瘤裸鼠（Z=2.00-2.01，均P＜0.05）。阻断处理后体内分布4h时的T/M比值由4.95±0.09降到了1.34±0.04，差异有统计学意义(Z=2.0016, P=0.0453＜0.05)。
　　荷瘤裸鼠体内显像结果示，SKOV3荷瘤裸鼠体内显像1h时肿瘤部位即可见放射性核素聚集，且随着时间延长，放射性聚集程度逐渐增加，T/NT比值10h时最高(6.61±0.09)。然而，EGFR低表达的MDA-MB-435S荷瘤裸鼠及阻断组SKOV3荷瘤裸鼠肿瘤部位始终未见明显放射性核素聚集，T/NT值均低于未阻断的SKOV3荷瘤裸鼠，各时间点均具有显著性差异(均P＜0.0001)。
　　结论:99Tcm标记的EGFR小分子靶向结合蛋白ZEGFR∶1907即刻标记率高，体内外稳定性好。99Tcm-ZEGFR∶1907分子探针可被EGFR高表达的肿瘤组织特异性摄取，且肿瘤细胞EGFR表达水平越高，其对探针摄取越高。在体内高表达EGFR肿瘤显像有明显的特异性99Tcm-ZEGFR∶1907浓聚，99Tcm-ZEGFR∶1907有望成为EGFR表达阳性的肿瘤早期诊断和特异性监测的核素分子探针。

目录

声明

摘要

英文缩写

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 表皮生长因子受体分子显像的研究进展

致谢

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