基于BDNF介导的P13K/AKT信号通路补肾活血方药对血管性痴呆大鼠海马神经元保护机制研究

摘要

目的:血管性痴呆(VD)是指由一系列脑血管因素引起的，在脑组织损害基础上产生的以高级神经认知功能障碍为主的临床综合征。中医认为，肾精渐亏，脑髓空虚，瘀血阻络为本病的基本病机，治疗当以补肾活血为基本治法。前期研究表明，补肾活血方药可促进血管性痴呆小鼠脑组织BDNF mRNA的表达，提高脑组织BDNF含量，改善学习记忆能力，但该药通过BDNF介导的何种信号通路发挥作用尚不清楚。本课题通过观察补肾活血方药对VD大鼠行为学、脑海马神经元超微结构，以及BDNF、TrkB、PI3K、AKT等指标表达的影响，从调控PI3K/AKT信号通路角度揭示补肾活血方药诱导BDNF表达、保护神经元的作用机制。
　　方法:清洁级雄性SD大鼠75只，体重约250-300g，由河北医科大学实验动物中心提供。适应性喂养一周后，运用水迷宫实验剔除不合格大鼠，剩余70只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、尼莫地平对照组、补肾活血高剂量组、补肾活血低剂量组，每组各14只。
　　SD大鼠术前12小时禁食，4小时禁水，用10％水合氯醛（3.5ml/kg体重）腹腔注射麻醉大鼠。依据文献，予以常规消毒，颈部正中切口，钝性分离肌肉及结缔组织，分离双侧颈总动脉并用4号丝线结扎，逐层缝合肌肉和皮肤，缝合后于伤口局部皮下注射庆大霉素0.2万单位预防伤口感染，假手术组分离双侧颈动脉，但不结扎。
　　各药物治疗组在造模术后第3天按体重比例进行给药干预，补肾活血高剂量组以10.14g生药/kg体重的剂量灌服补肾活血方药液，补肾活血低剂量组以5.07g生药/kg体重灌服补肾活血方药液，尼莫地平对照组以11.06mg/kg浓度灌服尼莫地平药液。假手术组、模型组均以10ml/kg体重灌服生理盐水，每日1次，治疗天数为30d。造模及给药结束后剔除死亡大鼠，各组剩余只数分别为:假手术组12只，模型组11只，补肾活血高剂量组12只，补肾活血低剂量组11只，尼莫地平对照组11只。
　　治疗30d后，每组随机抽取3只大鼠处死，剥离大鼠脑海马，放入4％戊二醛中固定，H-7500型透射电子显微镜下观察海马CA1区神经元超微结构变化，照相并记录镜下图片结果。其余大鼠进行Morris水迷宫测试，主要包括定位航行实验、空间探索实验。行为学实验结束后各组大鼠断头取脑，western blot检测大鼠BDNF、TrkB、PI3K、AKT蛋白表达水平，RT-qPCR(Real-time quantitive PCR)法检测大鼠BDNF、TrkB、PI3K、AKT的mRNA表达。
　　本研究实验数据处理采用均数±标准差（(x)±s）表示，用SPSS forWindows16.0统计软件处理，比较采用单因素方差分析，然后用leastsignificant difference进行组间比较，显著性差异水平以0.05和0.01为标准。
　　结果:
　　1各组大鼠空间学习记忆能力实验结果
　　1.1定位航行实验
　　与假手术组相比，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长，差异有统计学意义(P＜0.01)，经药物干预后，各治疗组大鼠逃避潜伏期明显缩短，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。尼莫地平组、补肾活血低剂量组与补肾活血高剂量组相比，大鼠逃避潜伏期无统计学意义(P＞0.01)。
　　1.2空间探索实验
　　与假手术组相比，模型组大鼠穿越原平台次数及在原平台停留时间均明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01），经药物干预后，各治疗组大鼠穿越原平台次数及在原平台停留时间均明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。与补肾活血高剂量组相比，补肾活血低剂量组和尼莫地平组大鼠穿越原平台次数及在原平台停留时间均明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。
　　2各组大鼠神经元超微结构的观察
　　假手术组神经元形态正常，细胞器丰富，胞核大呈椭圆形，核膜完整，常染色质丰富，异染色质较少。模型组:神经元严重水肿，细胞器数量显著减少，线粒体大部分嵴和部分膜融合、模糊不清，嵴有断裂和缺失现象，粗面内质网有明显的颗粒融合或脱颗粒现象。补肾活血高剂量组:神经元轻度水肿，线粒体部分嵴和膜融合，模糊不清，粗面内质网出现颗粒融合、脱颗粒现象。突触小泡减少，突触间隙融合。补肾活血低剂量组和尼莫地平组超微结构表现接近，均可见神经元水肿，细胞器数量减少，线粒体大部分嵴和部分膜融合、模糊不清，嵴有断裂和缺失现象，粗面内质网有明显的颗粒融合或脱颗粒现象。
　　3各组大鼠脑海马BDNF、TrkB、PI3K、AKT蛋白表达量的变化
　　与假手术组相比，模型组大鼠脑海马BDNF和TrkB蛋白表达明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），经药物干预后，各治疗组大鼠脑海马BDNF和TrKB蛋白表达均明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。与补肾活血高剂量组相比，补肾活血低剂量组和尼莫地平对照组BDNF和TrKB蛋白表达均有所降低，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。
　　与假手术组相比，模型组大鼠脑海马PI3K和AKT蛋白表达明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)，经药物干预后，各治疗组大鼠脑海马PI3K和AKT蛋白表达均明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。与补肾活血高剂量组相比，补肾活血低剂量组和尼莫地平对照组PI3K和AKT蛋白表达均有所降低，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。
　　4各组大鼠脑海马BDNFmRNA、TrkBmRNA、PI3KmRNA、AKTmRNA表达相对含量的变化
　　与假手术组相比，模型组TrkBmRNA表达显著下降，差异有统计学意义(P＜0.05)，经药物干预后，各治疗组大鼠脑海马BDNFmRNA和TrkBmRNA表达均明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。与补肾活血高剂量组相比，补肾活血低剂量组和尼莫地平对照组BDNFmRNA表达均有所降低，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);尼莫地平对照组TrkBmRNA表达有所降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　与假手术组相比，模型组PI3KmRNA和AKTmRNA表达显著下降，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);经药物干预后，各治疗组大鼠脑海马PI3KmRNA和AKTmRNA表达均明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。与补肾活血高剂量组相比，补肾活血低剂量组和尼莫地平对照组PI3KmRNA表达均有所降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:
　　脑海马区缺血缺氧是导致VD大鼠学习记忆功能减退的重要原因。脑缺血后海马区BDNF水平降低，受体TrKB表达下降，以致其介导的PI3K/AKT信号通路障碍，加重对脑海马神经元的损伤，引起学习记忆功能受损。本研究结果表明:
　　1补肾活血方药能够减轻缺血对脑海马神经元的损伤，改善神经元的超微结构，促进VD大鼠学习记忆能力。
　　2补肾活血方能够从基因和蛋白水平调节大鼠海马BDNF和TrkB的表达，激发下游通路对神经元修复保护作用。
　　3补肾活血方能够调控BDNF介导的PI3K/AKT信号通路，减轻神经元缺血损伤。
　　4“肾藏精”，精气具有促进机体生长、发育作用，与BDNF促进神经发育成熟的作用相一致，BDNF及其介导的信号通路阻断可能为VD肾虚血瘀证候的生物学基础。

目录

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摘要

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材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 中药治疗血管性痴呆研究概况

致谢

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