异牛肝菌素诱导人胃癌细胞BGC-823凋亡的机制研究

摘要

目的:胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率与死亡率高居各种恶性肿瘤的前列。目前，胃癌的治疗包括手术、放疗、常规化疗、分子靶向治疗和生物治疗等。尽管如此，胃癌经过治疗后，其五年生存率仍然小于20％。
　　众所周知，临床上采取的放、化疗会产生严重的副作用。因此，寻找有效治疗恶性肿瘤而且毒副作用小的药物是目前医药工作者的迫切任务。近些年的研究工作表明，一些来自植物和真菌的代谢产物是这类药物的首选。一项研究报告表明1981-2002年间注册的65种抗癌药物中有48种是从天然产物中获得的。目前，从大型真菌中提取活性成分用于临床肿瘤的治疗是新药开发途径之一。
　　异牛肝菌素(iso-suillin)，是由褐环粘盖牛肝菌(Suillus luteus)子实体中得到的一种化合物，分子量为440.29，化学名为3，6-二羟基-[(2E，6E，10E)-3，7，11，15-六甲基十六碳-2，6，10，14-四烯]苯乙酯，是粘盖牛肝菌素suillin的同分异构体，属于聚异戊二烯酚类化合物。近年来研究发现，iso-suillin能够明显抑制肿瘤细胞活性。
　　本实验旨在观察iso-suillin对人胃癌细胞BGC-823增殖和凋亡的影响，并研究其诱导凋亡的分子机制。
　　方法:
　　1、细胞培养:BGC-823细胞以RPMI1640培养基培养，内含10％胎牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100μg/ml，置37℃、5％ CO2环境下培养。
　　2、MTT检测iso-suillin对BGC-823细胞的抑制作用:不同浓度的iso-suillin（0、3.5、7、14、28、56、112μmol/L）分别作用于对数生长期的BGC-823细胞24、48和72 h。定时检测细胞生长情况，每孔加入5 mg/mlMTT20μl，继续孵育4 h，离心吸去上清，加入二甲基亚砜(Dimethyl-sulfoxide，DMSO)裂解细胞。用酶标仪测490nm波长吸光值（A值），计算抑制率:抑制率(％)=[（对照组A-实验组A）/对照组A]×100％。得出iso-suillin作用的半数抑制浓度(IC50)。
　　3、细胞形态学观察:BGC-823细胞种于6孔板后用不同浓度的iso-suillin处理48 h。(1)在光学显微镜下观察iso-suillin对BGC-823细胞形态的影响。(2)荧光显微镜(Olympus，Japan)观察记录细胞形态变化。(3)采用透射电子显微镜观察细胞超微结构变化。
　　4、流式细胞术检测细胞凋亡率:细胞经药物作用后，经PBS冲洗，70％乙醇固定，50μg/ml碘化丙锭(propidium iodide，PI)染色30 min后，采用流式细胞仪分析。
　　5、蛋白印记检测相关蛋白表达:收集人胃癌BGC-823细胞，加入细胞裂解液提取蛋白，之后用试剂盒测定蛋白浓度。样品经SDS-PAGE电泳、硝酸纤维素膜转移、5％脱脂奶粉封闭、经一抗和二抗作用、ECL显影，用凝胶图像分析系统测定目的蛋白的光密度值，并与相对应的β-actin条带光密度比较，计算表达量。
　　6、统计学方法:所有数据以均数±标准差（(x)±s）表示，采用SPSS13.0统计软件进行统计，作单因素方差分析(One-Way ANOVA)，P＜0.05为有显著差异。
　　结果:
　　1、MTT法:实验结果显示，相同浓度的iso-suillin作用于BGC-823细胞后，其抑制率随时间的延长而增大。而在处理时间相同时，随药物浓度越高，其抑制率越大。
　　2、形态学的改变:(1)光镜结果显示，随着iso-suillin浓度的增加，细胞变小变圆，与周围细胞链接消失，脱壁，漂浮细胞增多。(2) DAPI染色后经荧光显微镜下观察结果显示，随着药物浓度的增加，BGC-823细胞出现细胞核固缩、染色质浓缩以及核碎裂等细胞凋亡的现象。(3)电镜结果显示，iso-suillin处理后细胞可见核染色质浓缩，边集于核膜下;细胞质也高度浓缩，体积缩小，电子密度增加。
　　3、流式细胞术检测细胞凋亡率:结果显示，不同药物浓度的处理组均出现凋亡峰，与对照组相比，处理组凋亡峰随着药物浓度的增加越来越明显。对照组及8、16、32μmol/L药物浓度处理组凋亡率分别是:（0.97±0.3）％、(14.18±1.2)％、（38.34±2.3）％、（50.72±1.7）％，实验组与对照组差异明显（P＜0.01）。
　　4、Iso-suillin对BGC-823细胞凋亡相关蛋白的影响:结果显示BGC-823细胞经0、8、16、32μmol/L iso-suillin处理48 h后，Caspase-3,Caspase-8，Caspase-9的表达产物随着iso-suillin处理浓度的增大，条带明显变宽、变深。统计结果显示:经iso-suillin处理后细胞中Caspase-3、-8、-9蛋白表达增高，与对照组细胞相比差异明显(P＜0.05)。
　　5、Iso-suillin对BGC-823细胞自噬体形成的影响
　　透射电镜结果显示:对照组细胞器形态结构正常，未见自噬体。与对照组相比，经iso-suillin处理后的细胞可见双层膜的自噬体增多。
　　结论:
　　1、Iso-suillin抑制人胃癌细胞株BGC-823的增殖，其抑制作用呈浓度和时间依赖性。
　　2、Iso-suillin能引起BGC-823细胞凋亡形态学改变。
　　3、Iso-suillin通过活化凋亡效应因子Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9诱导细胞凋亡发生。
　　4、Iso-suillin可能诱导了自噬的发生。

目录

声明

摘要

英文缩写

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 自噬与肿瘤关系的研究进展

致谢

个人简历