化浊解毒活血通络法对脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障紧密连接ZO-1和occludin表达的影响

摘要

目的：观察化浊解毒活血通络法对脑缺血再灌注损伤大鼠模型血脑屏障及其紧密连接ZO-1和occludin表达量的影响，从血脑屏障紧密连接蛋白的角度探索本方法对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。
　　方法：以改进后的Zea-Longa等人的线栓法通过阻断大鼠一侧（本实验选用右侧）大脑中动脉制造局部梗死性脑缺血再灌注损伤模型。实验选用成年SD大鼠共54只，均为雄性，随机分成假手术组（即正常组）、模型组、尼莫地平组（即对照组）、化浊解毒活血通络方高剂量组（下文简称“中药高剂量组”）、化浊解毒活血通络方中剂量组（下文简称“中药中剂量组”）、化浊解毒活血通络方低剂量组（下文简称“中药低剂量组”）6组，每组9只（n=9）。各组实验动物均于术后24小时进行神经系统功能缺损评分，给予相应药物治疗，假手术组与模型组两组以0.9％氯化钠替代药物灌胃，尼莫地平组给以尼莫地平溶液灌胃，应用中药治疗的三组大鼠分别予相应浓度的化浊解毒活血通络方中药汤剂灌胃。持续灌服治疗7天，记录实验动物治疗过程中的一般情况，7天后按实验计划再次评定各组实验动物神经系统功能缺损程度，完成后迅速断头处死，取各组大鼠梗死侧大脑半球脑组织分别进行HE染色，电子光镜下拍照，留取图象观察缺血区域脑组织细胞形态变化，免疫组化法检测ZO-1和occludin的表达，RT-PCR法检测该指标在各组大鼠缺血侧脑组织中的表达量。
　　结果：
　　1.各组神经系统功能缺损评分比较显示：手术后24h：假手术组大鼠无明显的神经系统功能缺损症状，模型组及各用药组均出现不同程度的神经系统功能缺损症状，各组之间差异无统计学意义。连续灌胃7d后：模型组与假手术组相比较，神经系统功能缺损评分升高明显；与模型组相比较，尼莫地平组与中药高剂量组神经系统功能缺损评分均出现明显下降；两组间神经系统功能缺损评分无明显统计学差异；中药低剂量组及中药中剂量组神经系统功能缺损程度有所减轻，两组之间神经系统功能缺损程度无明显差异。
　　2.各组HE染色结果：光镜下观察发现假手术组大鼠脑组织细胞分布整齐紧密，形态规则，细胞浆圆润丰富，染色均匀，呈紫红色，细胞核淡染呈蓝色；模型组大鼠缺血侧脑组织缺血中心区域可观察到细胞结构溶解破坏，大量坏死神经元细胞存在，细胞肿胀，体积增大，细胞核破裂或溶解。其余各用药组大鼠大脑缺血区域可观察到上述病理改变，中药低剂量组及中剂量组与模型组相比较缺血坏死区有所减小，尼莫地平组与中药高剂量组与模型组相比较缺血坏死区明显减小。
　　3.免疫组化法检测ZO-1表达的变化：光镜下阳性表达细胞胞浆染色呈棕黄色，细胞核呈圆形或类圆形，大多数阳性细胞于缺血区周围集中分布。假手术组ZO-1持续表达，呈现连续分布状态；与假手术中相比，模型组ZO-1表达明显减弱，仅呈散在少量点状阳性染色；与模型组相比，尼莫地平组与中药高剂量组ZO-1表达量都有明显增加，连续表达与间断表达并存，两组之间差异不明显；中药低剂量组、中药中剂量ZO-1表达量均有所增加，可见间断表达，两组之间差异无统计学意义。
　　4.免疫组化法检测occludin表达：光镜下阳性表达细胞胞浆染色呈棕黄色，细胞核呈圆形或类圆形，大多数阳性细胞于缺血区周围集中分布。假手术组occludin持续表达，呈现连续分布状态；与假手术中相比，模型组occludin表达明显减弱，仅呈少量点状散在阳性染色；与模型组相比，尼莫地平组与中药高剂量组occludin表达量均增加明显，连续表达与间断表达并存，两组之间无明显差异；中药低剂量组、中药中剂量occludin表达量均有所增加，可见间断表达，中药中剂量组较中药低剂量组增加明显。
　　5.RT-PCR法检测ZO-1表达：模型组与假手术组比较， ZO-1表达量明显降低；与模型组相比，尼莫地平组与中药高剂量组ZO-1表达量均明显升高；两组之间无明显统计学差异；中药低剂量组、中药中剂量 ZO-1表达量均有增加，两组之间无明显差异。
　　6.RT-PCR法检测occludin表达：模型组与假手术组比较，occludin表达量明显降低；与模型组相比，尼莫地平组与中药高剂量组occludin表达量均显著升高；两组之间无明显统计学差异；中药低剂量组、中药中剂量组occludin表达量均有增加，两组之间无明显差异。
　　结论：
　　1.化浊解毒活血通络法可以减轻脑缺血再灌注损伤模型大鼠神经系统功能缺损程度，促进肢体功能的恢复，减轻大鼠脑组织缺血区域的细胞损伤。
　　2.化浊解毒活血通络法对脑缺血再灌注损伤模型大鼠缺血脑组织具有一定的的神经保护作用，其机制可能与保护血脑屏障和增加紧密连接蛋白ZO-1及occludin的表达有关。