小脑颗粒神经元凋亡时calpain切割GSK-3β的研究

摘要

GSK—3β(glycogen synthase kinase—3β)是促神经元凋亡的关键激酶。GSK—3β活性主要受自身N末端及C末端的磷酸化位点调控。当Scr9被磷酸化后，N—末端可作为假底物与GSK—3β的R96位结合，从而抑制了GSK—3β的活性；同时GSK—3β的C末端的Ser389被P38MAPK直接磷酸化而抑制GSK—3β的活性，从而使β—catenin聚集，促进细胞存活。因此，GSK—3β的Ser9及Ser389磷酸化具有抑制GSK—3β活性的作用。 体外神经元存活有赖于神经营养因子以及一定的“电活性”；当采用25mMKCI模拟体内“电活性”，维持神经元存活。当KCI韵浓度换成5mM，神经元发生典型的凋亡，此凋亡模型已被广泛应用于中枢神经元凋亡机制的研究。此外，谷氨酸诱导的小脑颗粒神经元凋亡模型也广泛用于神经元信号转导通路研究，一些关键的调控细胞凋亡的激酶已经在谷氨酸凋亡模型被阐明：如PI3K/AKT、p38等。 我们观察到：在撤钾诱导CGNs凋亡模型，GSK—3β的N端被calpain切割，并提示C端也被切割，但仍缺乏C端直接切割证据。calpain切割对调控GSK—3β的活性可能具有重要的生物学意义：因为，缺少抑制性N—末端及C末端的GSK—3β，将可能不受上游激酶磷酸化的抑制，呈现组成性(constitutive)激活的特点。这一现象的发现，将可能揭示一种调控GSK—3β活性的新机制，即通过剪切N—末端及C—末端解除抑制的方式激活GSK—3β。 我们将在前期工作上进一步研究calpain切割对GSK—3β的调控：是否GSK—3βC端也被calpain直接切割？切割确切发生在GSK—3βN—末端及C末端的哪个氨基酸残基？是否象预测一样，切割产物tGSK—3β活性将变得更强或具有组成性激活的特点？tGSK—3β是否具有更强的促神经元凋亡作用？这一切割调控是否具有普遍性？ 因此，本课题研究内容如下： 1、谷氨酸诱导小脑颗粒神经元凋亡时GSK—3β是否发生切割？是否N、C末端也被切割？ 2、撤钾诱导小脑颗粒神经元凋亡时GSK—3βC端是否也被切割？ 3、切割发生在GSK—3βN—末端及C末端的哪个氨基酸残基？ 实验方法和结果: 一、谷氨酸诱导小脑颗粒神经元凋亡时GSK—3β的被calpain切割。 1.谷氨酸诱导小脑颗粒神经元凋亡模型建立体外培养第7天的小脑颗粒神经元，加入不同浓度的谷氨酸(10μM、30μM、50μM、70μM、100μM)，以血清做对照。加药10mins后用相差显微镜观察神经元形态学变化，可见血清组神经元胞体饱满透亮，轴突与树突清晰而且完整，而谷氨酸刺激后，神经元胞体出现肿胀变圆、变黑，树突轴突断裂，并随着谷氨酸浓度的增加而逐渐明显。处理24小时后，采用Hoechst33258、PI和FDA染色统计凋亡率，结果表明谷氨酸刺激使神经元发生典型的凋亡，且凋亡率随谷氨酸浓度增加而升高。以上表明成功建立了谷氨酸凋亡模型。 2.谷氨酸浓度梯度证实GSK—3β被切割建立谷氨酸模型，以不同浓度的谷氨酸(10μM、30μM、50μM、70μM、100μM)，刺激DIV7的小脑颗粒神经元24h，WB检测GSK—3β的切割情况。结果发现谷氨酸刺激后GSK—3β发生切割。 3.时间梯度证实GSK—3β被切割以50μM作为谷氨酸中毒浓度，选择不同的时间点(2h、4h、8h、12h、24h)，WB检测GSK—3β，同样观察到GSK—3β发生了切割。同时检测谷氨酸模型公认被切割CRMP—4，可见随着时间点的递增，CRMP—4切割逐渐增加，验证了模型的可靠性。 4.GSK—3β的N、C端被切割建立谷氨酸模型，以50μM谷氨酸刺激DIV7的小脑颗粒神经元24h，用GSK—3β的N端抗体Geneway(21-36aa)和C端抗体G7914(403-420aa)检测GSK—3β的切割情况，分别检测到对应的切割条带，证实了GSK—3β的N、C端被切割。 5.calpain而非caspase—3介导GSK—3β的切割。 建立谷氨酸模型，并加入calpain抑制剂ALLM(50uM)观察对GSK—3β切割的影响，结果表明ALLM很好抑制了GSK—3β切割的发生，证实calpain介导了GSK—3β的切割。 而同时我们在谷氨酸模型检测了另一神经元凋亡相关蛋白酶Caspase—3，发现谷氨酸刺激小脑颗粒并未激活caspase—3，可以排除caspase—3介导切割GSK—3β。 二、撤钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡时GSK—3βC端也被切割我们前期研究发现，撤钾诱导小脑颗粒神经元凋亡时GSK—3β被切割，且利用识别GSK—3最C末端的抗体可以检测到切割带，表明GSK—3β的N端发生切割，但是由于缺乏识别GSK—3βN端豹抗体，因而无法证实GSK—3β的C端是否被切割。在本课题研究中，我们利用识别GSK—3β最N端的抗体检测撤钾诱导小脑颗粒神经元凋亡时GSK—3β情况，观察到GSK—3β的切割条带，表明撤钾凋亡时GSK—3βC端也被切割。 三、GSK—3β切割位点鉴定: 1、双向电泳分离Westernblotting提示GSK—3β的N、C端切割条带以及calpain自切条带相互重合，拟通过双向电泳方法分离切割片段。His—GSK—3β体外切割，跑双向电泳转PVDF膜，用GSK—3中间抗体sc9166孵育，检测蛋白斑点，未检测到切割斑点。 2、Edman测序和质谱鉴定位点His—GSK—3β体外切割，跑SDS—PAGE，转膜PVDF，考染送切割条带N端Edman测序，或者考染后切胶胰酶消化，质谱TOF/TOF鉴定位点。Edman测序结果为calpain切割位点：质谱TOF/TOF未筛选到有效目的肽段，正在深入研究中。 结论: 1、谷氨酸诱导的小脑颗粒神经元凋亡时，GSK—3β被calpain切割。 2、小脑颗粒神经元凋亡时，GSK—3β的N、C端均被切割。

目录

文摘

英文文摘

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声明

第一章前言

第二章材料与方法

第三章实验结果

第四章讨论

第五章结论

参考文献

硕士期间发表文章

致谢