Toll样受体-9通路增强前列腺癌细胞抗凋亡及侵袭、转移能力的研究

摘要

越来越多的流行病学及实验室研究均发现慢性炎症促进肿瘤的发生、发展。体内免疫细胞通过Toll样受体对消灭病原体、清除炎症发挥重要作用。Toll样蛋白受体在免疫细胞上广泛表达，它可识别微生物体内的天然配体(如细菌或病毒DNA等)，然后激发免疫及炎症反应。最近的研究发现TLRs在肿瘤细胞中也有表达，然而，在水火不相容的免疫细胞和肿瘤细胞中均有表达，其真正的意义仍不清楚。在本研究中，我们发现TLR9表达于前列腺癌细胞中，TLR9特异性激动剂可以增强前列腺癌细胞对抗TRAIL所诱导的细胞凋亡的耐受能力；也可以上调细胞因子COX—2、IL—8、TGF—β1的表达及分泌。不仅如此，结果提示TLR9激动剂还可以激活NF—KB，且NF—KB的激活是COX—2、IL—8、TGF—β1的表达上调所必须的，也是CpG—ODN诱导的细胞抗凋亡能力增强所必须的。 接着，选取TLR9下游细胞因子之一COX—2在组织标本中进行研究，我们应用免疫组化方法检测了58例前列腺癌组织中COX—2及VEGF—C的表达情况，结果发现COX—2与VEGF—C两者的表达密切相关，且这两个蛋白的表达均与肿瘤淋巴管形成、淋巴管侵犯及淋巴结转移呈正相关的关系。这一结果提示在前列腺癌中，COX—2也许是通过上调VEGF—C的表达而促进淋巴管形成、发生淋巴结转移的。 因此，本研究显示TLR9在前列腺癌细胞上存在功能性的表达，它可以通过增强肿瘤细胞抗凋亡、上调细胞因子的表达、诱导肿瘤新生淋巴管形成、促进肿瘤淋巴结转移等最终加速肿瘤的恶性进程。 本研究包括3个部分：第一部分，前列腺癌PC—3细胞在TLR9的激动剂CpG—ODN作用下，细胞对抗TRAIL诱导的细胞凋亡的耐受能力明显增强，而且这一现象能被TLR9的抑制剂chloroquine及NF—ΚB的特异性阻断剂PDTC所减弱，提示TLR9通路通过激活NF—ΚB实现细胞抗凋亡能力的增强。第二部分，CpG通过TLR9通路上调细胞因子COX—2、IL—8、TGF—β1的表达，而且这一作用能被NF—ΚB的特异性阻断剂PDTC消除，提示CpG—ODN通过激活NF—ΚB而上调COX—2、IL—8、TGF—β1的表达。第三部分，为了更好地了解TLR9对前列腺癌转移的作用，我们选择了一种TLR9下游的细胞因子COX—2在前列腺癌组织标本上做后继研究，我们发现，COX—2和VEGF—C的表达密切相关，而这两者均与肿瘤新生淋巴管形成、淋巴管侵犯及淋巴结转移呈正相关的关系，提示COX—2也许是通过上调VEGF—C的表达而最终促进前列腺癌发生侵犯、转移，加速肿瘤的恶性进程。 第一部分Toll样受体9通路体外增强前列腺癌PC—3细胞抗凋亡能力的研究 目的：大量的研究结果显示慢性炎症可以加速肿瘤的恶性进程，在这一过程中TLRs可能起了重要的作用。本研究目的是了解CpG—ODN是否能够通过TLR9信号途径增强前列腺癌PC—3细胞的抗凋亡能力。 方法：应用RT—PCR、流式细胞术、及免疫荧光技术检测了前列腺癌细胞上TLRs包括TLR9的表达情况，以及应用CpG刺激前后细胞对抗TRAIL诱导的凋亡耐受能力，同时检测了NF—ΚB激活情况以及其在细胞抗凋亡能力提高的过程中的所起的作用。 结果：TLR9激动剂CpG—ODN能够激活NF—ΚB使其进行核转位、增强PC—3细胞对抗TRAIL诱导的细胞凋亡的耐受能力。PC—3细胞NF—ΚB的激活及抗凋亡能力的增强均能够被TLR9抑制剂chloroquine所减弱，提示这一过程通过TLR9通路发挥作用；同时，NF—ΚB的特异性阻断剂PDTC也能明显削弱PC—3细胞抗凋亡能力的增强。 结论：TLR9激动剂CpG—ODN能够增强PC—3细胞对抗TRAIL诱导的细胞凋亡的耐受能力，该过程至少部分通过了NF—KB的激活来完成的，这个结果提示：慢性炎症可以通过TLR9信号通路加速肿瘤的恶性进程。 第二部分TLR9激动剂通过激活NF—κB上调细胞因子COX—2、IL—8、TGF—β1的表达 目的：最近的研究显示CpG—ODN在体外可通过Toll样受体9(TLR9)通路增强前列腺癌细胞侵袭和转移能力。由于环氧合酶—2(COX—2)、转化生长因子—β1(TGF—β1)及白介素—8(IL—8)在多种肿瘤包括前列腺癌中呈过表达，是肿瘤进展、侵袭及转移的重要促进因子。本实验旨在探讨在前列腺癌中TLR9通路激活是否可以上调COX—2，TGF—β1及IL—8的表达。 方法：PC—3细胞经CpG—ODN刺激后，通过应用流式细胞术、半定量RT—PCR、ELISA、及westernbolt等手段，检测了COX—2，TGF—β1，及IL—8的表达情况，同时应用免疫荧光染色检测了核转录因子—κB(NF—κB)的激活，以及NF—κB的激活在COX—2，TGF—β1及IL—8的上调表达过程中的作用。 结果：CpG—ODN可以上调COX—2，TGF—β1，及IL—8的表达，并具有刺激的浓度、时间依赖性；同时，经CpG—ODN刺激后，NF—κB被激活，P65转移入核内；NF—κB的激活在CpG—ODN上调COX—2，TGF—β1，及IL—8表达的过程中发挥重要的作用。 结论：前列腺癌细胞中TLR9通路的激活能够上调COX—2，TGF—β1及IL—8的表达，该过程部分通过激活NF—κB而实现的，提示TLR9通路的激活也许可以通过这些途径而增强前列腺癌细胞的侵袭、转移能力。 第三部分COX—2通过上调VEGF—C的表达促进前列腺癌新生淋巴管形成及淋巴结转移 目的：大量的研究表明环氧合酶—2能够促进前列腺癌的淋巴转移，而且可以上调一些肿瘤组织中新生淋巴管形成及血管内皮生长—C的表达。本研究旨在探讨在前列腺癌组织中COX—2能否上调VEGF—C的表达。 方法：通过应用免疫组化方法检测58例前列腺癌组织中COX—2、VEGF—C及D2-40的表达，并分析COX—2的表达与VEGF—C、微淋巴管密度、及临床病理指标的相关性。 结果：前列腺组织中COX—2与VEGF—C的表达有较强的相关性(r=0.631，p<0.001)，COX—2和VEGF—C的高表达与肿瘤淋巴管形成、淋巴结转移及无生化复发生存率(b—PFS)等临床指标有关。 结论：前列腺癌中COX—2的表达与VEGF—C的表达及肿瘤淋巴转移有相关性，提示COX—2可能通过上调VEGF—C的表达而促进前列腺癌的淋巴转移。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前言

第一部分 Toll样受体9通路体外增强前列腺癌PC-3细胞抗凋亡能力的研究

1.1 材料与方法

1.2结 果

1.3讨 论

1.4结论

第二部分Toll-like受体9通路上调前列腺癌细胞表达免疫抑制因子COX-2、IL-8、TGF-β1的研究

2.1材料与方法

2.2结 果

2.3讨 论

2.4结论

第三部分前列腺癌组织中环氧合酶-2上调淋巴管内皮生长因子VEGF-C表达的研究

3.1材料与方法

3.2结 果

3.3讨论

3.4结论

全文结论

结束语

本课题创新之处

展望

参考文献

在读期间发表的论文及参与的科研学术活动

致 谢