NF-κB过度激活损害C2C12骨骼肌细胞胰岛素敏感性且介导棕榈酸所致胰岛素抵抗

摘要

目前已有的研究提示骨骼肌中脂质诱导的胰岛素抵抗可能与IKKβ/IκBα/NF-κB途径激活相关。体内外均有研究发现阻断该通路可避免或改善FFA对肌细胞胰岛素作用的不利影响，因而有观点认为该炎症通路的激活与骨骼肌胰岛素抵抗存有因果关系。然而此观点也遭到了质疑，Polkinghorne在大鼠活体的单肌肉组织中通过电转染携有目的基因质粒的方法高表达p65和IKKβ一周，得出未发现IKKβ/NF-κB与肌组织胰岛素抵抗有明确相关性的结论。即便支持两者有因果关系的研究者们对NF-κB在该过程中所起的作用也有分歧，支持NF-κB发挥关键作用的观点基于在肌细胞中抑制NF-κB的活性可改善多种因素所致的胰岛素功能受损；而另一种观点认为IKKβ是影响胰岛素敏感性更重要的分子靶点，理由为IKKβ可诱导胰岛素受体底物1(IRS-1)的丝氨酸磷酸化并损害胰岛素信号转导。
　　 本课题拟探讨NF-κB在骨骼肌胰岛素抵抗中所起的作用。NF-κB的过度激活是否在脂质诱导的骨骼肌胰岛素抵抗中发挥重要作用?NF-κB过度激活本身能否引起骨骼肌胰岛素抵抗?为解答上述问题，本研究采用siRNA技术特异性的抑制NF-κB p65，观察NF-κB在棕榈酸诱导的肌细胞胰岛素抵抗中所起的作用；并同样采用siRNA技术抑制IκBα，以期过度激活NF-κB，并观察其对肌细胞胰岛素功能的影响。
　　 本研究内容分为三个部分
　　 1.以不同浓度梯度的棕榈酸作用于C2C12骨骼肌细胞，观察其对NF-κB p65的表达和葡萄糖摄取的影响，以及两者之间是否存在相关性。
　　 2.利用siRNA技术抑制NF-κB p65和IκBα基因在小鼠C2C12骨骼肌细胞中的表达。
　　 3.以棕榈酸、IκBαsiRNA、棕榈酸联合NF-κB p65 siRNA作为干预因素处理C2C12细胞，检测NF-κB活性和胰岛素功能相关指标。
　　 第一部分：不同浓度梯度的棕榈酸对C2C12骨骼肌细胞葡萄糖摄取及NF-κB活性的影响
　　 研究目的：
　　 以不同浓度梯度的棕榈酸作用于C2C12骨骼肌细胞，观察其对NF-κB p65活性和葡萄糖摄取的影响，并观察两者之间是否存在相关性。
　　 研究方法：
　　 1.细胞培养及干预
　　 C2C12成肌细胞在含有10％FBS的高糖DMEM增殖培养基中培养，在约达到80％融合时换成含有2％HS的高糖DMEM分化培养基培养，隔天换液一次，约4天后成肌细胞分化成为肌管。分别用不同浓度的棕榈酸(0，0.25，0.50，0.75和1.0 mM)处理肌管16小时。
　　 2.氚标葡萄糖摄取率检测
　　 各浓度棕榈酸处理后的肌管细胞分别行基础葡萄糖摄取率检测和胰岛素刺激后葡萄糖摄取率检测。通过液体闪烁计数仪测定[3H]2-脱氧葡萄糖(2DG)放射活性，并以Bradford法测定样品蛋白浓度较正2DG摄取率结果。最后结果=样品每分钟衰变数/相应蛋白浓度(cpm/mg protein)。
　　 3.NF-κB活性检测
　　 提取各组细胞总蛋白，用Western Blotting方法检测NF-κB蛋白表达及其磷酸化，并检测NF-κB抑制蛋白IκBα的表达。β-actin为内参照，曝光后的胶片用Quantity One软件对条带进行密度扫描分析。
　　 4.统计学分析
　　 采用SPSS for Windows16.0统计软件包进行分析处理。实验数据首先进行正态分布检验，符合正态分布或经转换后呈正态分布者用均数±标准差(means±SD)形式表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方查齐性则组间比较采用SNK-q检验，两组间比较采用Student's t检验，p＜0.05视为有统计学意义。
　　 结论：
　　 1.使用不同浓度棕榈酸(0、0.25、0.50、0.75、1.00 mM)作用于C2C12骨骼肌细胞，当棕榈酸浓度超过0.50mM时，可观察到胰岛素刺激后2DG摄取量减少、IκBα蛋白表达减少及NF-κB活性增强，且胰岛素刺激后2DG摄取量的减少与NF-κB活性的增强之间有相关性。提示棕榈酸刺激细胞后至少部分通过降解IκBα激活NF-κB，且NF-κB的激活可能参与了棕榈酸所致的骨骼肌细胞胰岛素抵抗。
　　 2.棕榈酸浓度在0.75mM可达到较好的胰岛素刺激后的2-DG摄取率抑制效果，因而采用该浓度进一步研究NF-κB在胰岛素抵抗中所起的作用。
　　 第二部分：siRNA抑制C2C12骨骼肌细胞NF-κB p65和IκBα基因表达
　　 研究目的：
　　 使用siRNA技术抑制C2C12骨骼肌细胞NF-κB p65和IκBα基因的表达
　　 研究方法：
　　 1.siRNA制备
　　 化学合成3对NF-κB p65 siRNA,3对IκBαsiRNA，1对阴性对照siRNA及1对FAM标记阴性对照siRNA，由GenePharma公司合成。
　　 2.细胞培养
　　 C2C12成肌细胞培养并分化为肌管。
　　 3.siRNA转染
　　 使用LipofectamineTM2000转染试剂按说明书操作。优化转染条件，选择最佳siRNA转染浓度和转染比例，在最优染条件下分别转染3对NF-κB p65 siRNA、3对IκBαsiRNA及1对阴性对照siRNA。
　　 4.检测基因抑制效率
　　 在转染后24、48、72h后收集细胞，提取总的RNA和蛋白质，分别用RT-PCR和Western Blotting方法检测目的基因的表达。
　　 5.统计分析
　　 实验数据用均数±标准差(means±SD)形式表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)及SNK-q检验，两组间比较采用Student'st检验，p＜0.05视为有统计学意义。
　　 结论：使用RNA干扰(RNAi)技术分别筛选出有效的NF-κB p65 siRNA和IκBαsiRNA，为进一步研究打下基础。
　　 第三部分NF-κB对胰岛素功能的影响研究
　　 目的：
　　 探讨NF-κB在胰岛素抵抗中所起的作用。以棕榈酸作为干预因素处理C2C12骨骼肌细胞，通过抑制NF-κB p65表达观察NF-κB是否介导棕榈酸所致的胰岛素抵抗；通过抑制IκBα以期过度激活NF-κB，观察能否引起胰岛素敏感性下降。
　　 研究方法：
　　 1.细胞培养
　　 C2C12成肌细胞培养并分化为肌管。
　　 2.实验分组
　　 完全分化成熟的肌管细胞分为六组，分别转染p65 siRNA(1组)、IκBαsiRNA(1组)、阴性对照siRNA(2组)及仅加入转染试剂(2组)，24h后部分细胞加入0.75mM棕榈酸孵育16h。
　　 A组：阴性对照组(转染试剂)
　　 B组：con siRNA对照组(阴性对照siRNA)
　　 C组：棕榈酸处理组(转染试剂+棕榈酸)
　　 D组：棕榈酸+con siRNA处理组(阴性对照siRNA+棕榈酸)
　　 E组：IκBαsiRNA处理组(IκBαsiRNA)
　　 F组：棕榈酸+p65 siRNA处理组(p65 siRNA+棕榈酸)
　　 3.NF-κB活性检测
　　 提取细胞核蛋白并经Bradford法定量至同等浓度，再以电泳迁移率变动分析法(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)检测NF-κB活性，NF-κB探针采用[γ-32p]ATP标记。为保证实验特异性，每次实验均设立阴性对照、阳性对照、特异性竞争对照和非特异性竞争对照。
　　 4.2DG摄取率检测
　　 六组细胞分别行基础2DG摄取率检测和胰岛素刺激后2DG摄取率检测，方法同前。并比较各组细胞净胰岛素刺激的2DG摄取率(胰岛素刺激后2DG摄取率-基础2DG摄取率)。
　　 5.GLUT4总蛋白和膜蛋白检测
　　 分别用100nM胰岛素干预前述六组细胞，并加设一组未经胰岛素作用的肌管细胞作为基础状态下阴性对照组，分别提取细胞的总蛋白和膜蛋白，WesternBlotting检测GLUT4总蛋白和膜蛋白的表达。
　　 6.胰岛素信号蛋白检测
　　 六组细胞分别提取细胞总蛋白，Western Blotting检测胰岛素刺激后的IRS-1蛋白表达及其磷酸化、AKT蛋白表达及其磷酸化。
　　 7.统计分析
　　 实验数据用均数±标准差(means±SD)形式表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方查齐性则组间比较采用SNK-q检验，两组间比较采用Student's t检验，p＜0.05视为有统计学意义。
　　 结论：
　　 NF-κB的过度激活在胰岛素抵抗的发病中发挥了重要作用。NF-κB介导了棕榈酸所致的骨骼肌胰岛素抵抗，且NF-κB过度激活本身足以损害胰岛素敏感性。

目录

文摘

英文文摘

声明

引 言

第一部分不同浓度梯度的棕榈酸对C2C12骨骼肌细胞葡萄糖摄取及NF-κB活性的影响

材料和方法

实验结果

讨论

小结

第二部分siRNA抑制C2C12骨骼肌细胞NF-κBp65和IκBα基因的表达

材料和方法

实验结果

讨论

小结

第三部分 NF-κB激活在骨骼肌胰岛素抵抗过程中所起的作用

材料和方法

实验结果

讨论

小结

结 论

参考文献

附录

致 谢

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