食管鳞癌患者术前外周血CK19mRNA的表达及其临床意义

摘要

背景：食管癌是常见的恶性肿瘤，我国的食管癌发病率、死亡率居世界首位，2005年全国食管癌新发病例为185211例，估计每年约20万人死于食管癌。尽管食管癌的诊断和治疗的技术不断提高，可切除食管癌术后的5年生存率一直徘徊在30％左右。治疗失败的主要原因是局部复发和远处转移，而部分复发或转移的原因可能是行手术时已经存在常规病理检查无法发现的微转移。早期发现这些微转移并进行针对性治疗是提高食管癌治疗效果的有效途径，但目前临床上尚缺食管癌微转移的有效诊断手段。目前，检测肿瘤微转移方法主要有：传统组织病理切片、免疫组织化学(IHC)、流式细胞学及聚合酶链反应(PCR)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)等。RT-PCR无论是在敏感性还是特异性方面均优于其它方法，目前有大量肿瘤微转移的研究利用这种方法。由于多数实体瘤细胞缺乏肿瘤特异性基因，目前对微转移的研究多采用组织特异性基因。用于检测微转移上皮细胞组织特异性墓因以细胞角蛋白最为常见。细胞角蛋白表达于正常上皮细胞和上皮癌细胞中，而在间叶组织来源的器官如血液、骨髓、淋巴结等中不表达，已经广泛应用于很多研究，尤其是其家族中的CK19。CK19 mRNA作为上皮特异性标志物，正常的食管上皮和食管癌组织中存在高表达，可以作为检测非上皮组织中食管癌肿瘤细胞存在的有用标志物。本研究组已经成功应用RT-PCR技术完成了对根治性术前食管鳞癌骨髓CK19mRNA的表达与临床、病理及预后关系的研究，结果表明骨髓CK19mRNA的表达是其的预后差的独立预后因素。但骨髓取材是有创检查，相对外周血更费时、疼痛，不易得到术前或非手术患者的配合。目前认为血液中循环肿瘤细胞的存在是血源性播散并引起远处转移的预测性指标，其出现是一个预后差的独立预后因素。外周血的检测相对于骨髓而言则方便了许多，并且可以反复多次地采血，易于动态观察外周血中肿瘤细胞的变化，可以对疾病的诊断和辅助治疗有动态的指导意义。
　　 目的：利用RT-PCR技术，检测根治性食管鳞癌患者术前外周血CK19mRNA的表达，探讨其表达与临床、病理及预后的关系。
　　 方法：(1)建立食管癌外周血微转移模型，进行微转移检测以确定其敏感性：应用10倍稀释法，分别在105、104、103、102、101、100和0个食管癌EC81细胞株中置入健康人107外周血单核细胞(PBMN)，建成含不同EC81细胞数体外食管癌微转移模型，行CK19mRNA的RT-PCR反应检测其敏感性。(2)食管及肺良性肿瘤患者外周血标本进行微转移检测以确定其特异性：选择中山大学肿瘤防治中心自2006年10月到2007年5月间收治的20例食管及肺良性肿瘤患者，术前空腹采集外周静脉血标本，行CK19mRNA的RT-PCR反应检测其特异性。(3)行根治性食管鳞癌患者手术前外周血CKmRNA的表达：收集中山大学肿瘤防治中心自2006年10月到2007年5月间收治的食管癌根治性手术患者62例，术前空腹采集外周静脉血标本，行CK19mRNA的RT-PCR反应检测其外周血CK19mRNA的表达情况。(4)收集实验数据、临床及随访资料，进行统计学分析，评估62例患者外周血CK19mRNA表达与临床病理因素之间及预后的关系。
　　 结果：CK19 mRNA RT-PCR法检测食管癌外周血微转移的敏感性为10-7，特异性为100％(20例食管肺良性肿瘤患者行无一例表达)，是较好的食管癌外周血微转移检测方法。本研究中，62例行根治性食管鳞癌患者中，CK19 mRNA在10例患者有表达，阳性率为16.1％(10/62)。CK19 mRNA的表达与根治性食管鳞癌患者的临床病珲因素(如：性别、年龄、肿瘤位置、临床分期、肿瘤浸润深度、淋巴结转移情况、肿瘤细胞分化程度)之间均没有相关性，术后随访1-40个月，平均26.4个月，随访期间33例复发或转移(33/62，53.2％)，其中外周血CK19mRNA阳性患者复发或转移9例(9/10，90％)，外周血CK19mRNA阴性患者复发或转移24例(24/52，46.2％)。行根治性术前外周血CK19 mRNA阳性的患者有较高的复发率和有较差的生存期(Fisher's Exact Test，P=0.015)，有较短的无瘤生存期(Mann-Whitney U，p=0.02)，有较常见的肿瘤相关性死亡(Fisher's Exact Test，P=0.029)，统计学均有差异。多因素分析表明行根治性食管鳞癌患者术前外周血CK19mRNA是其预后较差的独立预后因素(p=0.011，RR,6.528，95％CI，1.287～6.786)。
　　 结论：RT-PCR法检测食管癌患者外周血CK19mRNA的表达具有较高敏感性和特异性。CK19mRNA可以用来作为检测食管鳞癌患者外周血微转移的分子标志物。行根治性手术的食管鳞癌患者术前外周血CK19mRNA表达与临床病理因素之间无关，术前外周血CK19 mRNA阳性的患者有较高的复发率和有较差的生存期。外周血CK19 mRNA的表达是其预后较差的独立预后因素。

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论文说明：中英文缩写词

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第一章 引 言

第二章材料与方法

2.1.临床资料

2.1.1研究对象

2.2实验标本的取材

2.3主要试剂和仪器

2.3.1实验细胞株

2.3.2实验试剂及设备

2.4.实验方法

2.4.1细胞培养

2.4.2体外食管癌微转移模型的建立

2.4.3 RT-PCR CK19敏感性的测定

2.4.4 RT-PCR CK19特异性的测定及食管癌外周血CK19mRNA的测定

2.4.5： RT-PCR扩增产物分析

2.5：随访及预后

2.6：统计分析

第三章实验结果

3.1细胞总RNA的提取

3.1.1细胞总RNA纯度的测定

3.1.2细胞总RNA行内参基因β-actin的RT-PCR分析结果

3.2 RT-PCR产物序列测定

3.3RT-PCR技术检测食管癌细胞株CK19 mRNA表达的敏感性

3.4.RT-PCR技术检测CK19 mRNA表达的特异性

3.5. RT-PCR技术检测食管鳞癌患者中CK19 mRNA的表达

3.6.外周血CK19mRNA表达与食管鳞癌患者临床病理因素的关系

3.7.外周血CK19mRNA表达与食管鳞癌根治术后患者复发或转移和肿瘤相关性死亡的关系

3.8：预后分析

第四章 讨论

4.1： RT-PCR技术检测外周血CK19 mRNA表达的敏感性和特异性

4.2:外周血CK19 mRNA表达与临床及病理之间的关系

4.3:外周血CK19 mRNA表达与预后之间的关系

第五章 结论

第六章 参考文献

致谢