积雪草酸抗四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化的实验研究

摘要

肝纤维化(hepatic fibrosis)是继发于各种慢性肝脏损伤的一种修复反应，是细胞外基质(extra-cellular matrix，ECM)的合成大于降解，导致ECM在肝脏大量沉积的结果。肝纤维化继续进展，可发展成肝硬化，最终引起肝功能损害、门静脉高压甚至可发展为肝癌。研究表明，早期肝纤维化是可逆的，及时采取有效的措施有可能延缓甚至逆转其进展。近年来中医药抗肝纤维化的研究有了很大进展，从实验动物、细胞水平、分子生物学水平，多层次、多靶点、多途径地探索了其作用和机制。积雪草酸(asiatic acid，AA)是从中草药积雪草(Centellaasiatica)的提取所得的五环三萜类化合物，具有抗炎、保肝、抗氧化、抗肿瘤、保护神经等多种药理作用。
　　 本文以雄性SD大鼠为研究对象，使用肝毒性的四氯化碳(carbontetrachloride，CCl4)诱导大鼠慢性肝损伤制造肝纤维化模型，采用0.5mg/kg，2mg/kg，8mg/kg三个剂量的积雪草酸进行干预，研究不同剂量AA对肝脏血清酶谱、肝脏组织病理、胶原成分的影响，并探索其保护肝脏、阻断肝纤维化的作用和机制。
　　 第一部分积雪草酸对CCl4诱导的大鼠血清酶指标的影响
　　 目的：建立CCl4诱导的肝纤维化大鼠模型，观察积雪草酸对CCl4诱导的大鼠肝脏损伤的保护作用。
　　 方法：将40只SD大鼠随机分为5个组，分别为正常组，模型组和3个剂量的AA治疗组(0.5mg/kg，2mg/kg，8mg/kg)，每组7-8只。模型组和AA治疗组按2ml/kg予腹腔注射20％四氯化碳花生油诱导肝纤维化，一周2次，共6周；正常组腹腔注射等量花生油做对照。3个剂量的AA治疗组同时按每公斤体重分别给予0.5mg，2mg，8mg AA，与0.5％羧甲基纤维素混悬后灌胃，一天1次；正常组和模型组则给予等量0.5％羧甲基纤维素溶液。第6周时，处死大鼠，心脏采血离心获取血清检测ALT和AST活性。
　　 结果：与正常对照组比较，模型组血清ALT和AST水平分别升高了9倍和3倍(p＜0.01)；与模型组比较，AA0.5mg/kg治疗组ALT和AST水平降低不明显(p＞0.05)，而AA2mg/kg、AA8mg/kg治疗组ALT和AST水平明显降低(p＜0.05或p＜0.01)。
　　 结论：积雪草酸对肝毒性的CCl4导致的大鼠肝脏炎症损伤具有改善作用，其作用呈剂量依赖关系，AA2mg/kg、AA8mg/kg治疗组效果优于AA0.5mg/kg。
　　 第二部分积雪草酸对CCl4诱导的大鼠肝脏组织病理学和胶原成分的影响
　　 目的：观察积雪草酸对CCl4诱导的大鼠肝纤维化有无改善作用，观察积雪草酸对纤维化的肝脏中细胞外基质的影响。
　　 方法：取大鼠肝组织做H&E染色，观察肝组织形态改变；用免疫组织化学方法对实验大鼠肝组织分别做Ⅰ型和Ⅲ型胶原染色，并其进行半定量分析。
　　 结果：H&E染色显示模型组肝组织病理损害严重，肝小叶结构破坏，炎性细胞浸润，胶原增生显著，假小叶形成。AA治疗组与模型组相比，肝细胞和纤维结缔组织增生程度减轻，肝细胞坏死减轻，其中AA8mg/kg治疗组大鼠肝组织形态改善更明显。免疫组化结果显示模型组肝组织Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋自沉积明显增多，Ⅰ型和Ⅲ型胶原面积百分比分别为(4.12±1.20)％和(5.57±1.54)％，与模型组相比，AA治疗组胶原沉积程度有所减轻，Ⅰ型胶原面积百分比均明显降低(p＜0.0l或p＜0.001)；AA8mg/kg组Ⅲ型胶原面积百分比为(3.10±1.54)％，与模型组比较有显著性差异(p＜0.01)。
　　 结论：积雪草酸能改善CCl4诱导的大鼠肝纤维化，减少CCl4诱导的大鼠肝脏中Ⅰ型和Ⅲ型胶原沉积，且呈量效关系，AA8mg/kg组效果优于0.5mg/kg、2mg/kg组。
　　 第三部分积雪草酸对CCl4诱导的大鼠肝脏中α-SMA表达的影响目的：观察积雪草酸对α-SMA表达的调节作用，探讨积雪草酸治疗肝纤维化的作用机制。
　　 方法：采用实时荧光定量多聚酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹(western blot)方法，分别检测大鼠肝脏中α-SMAmRNA和α-SMA蛋白表达。
　　 结果：与模型组比较，AA0.5mg/kg治疗组α-SMA mRNA表达降低不明显(p＞0.05)，而AA2mg/kg、8mg/kg治疗组α-SMA mRNA表达水平下调(p＜0.05)。模型组肝组织α-SMA蛋白表达显著升高(p＜0.001)。与模型组比较，AA0.5mg/kg、2mg/kg治疗组α-SMA蛋白水平无明显差异(p＞0.05)，AA8mg/kgα-SMA蛋白表达水平明显降低(p＜0.001)。
　　 结论：积雪草酸能减少CCl4诱导的大鼠肝脏α-SMA表达，提示AA可能通过抑制HSCs活化增殖抑制肝纤维化，且具有量效关系，AA2mg/kg、8mg/kg组效果优于AA0.5mg/kg组。
　　 第四部分积雪草酸对CCl4诱导的大鼠肝脏中Smad7表达的影响
　　 目的：观察积雪草酸对Smad7表达的调节作用，探讨积雪草酸治疗肝纤维化的作用机制。
　　 方法：采用Real-time PCR和western blot方法检测大鼠肝脏中Smad7mRNA和Smad7蛋白的表达。
　　 结果：与模型组比较，AA8mg/kg治疗组Smad7 mRNA表达量增加了1倍(p＜0.05)，其余两个AA治疗组Smad7mRNA表达无上调。与模型组比较，三个AA治疗组Smad7蛋白表达均有明显升高。
　　 结论：积雪草酸能上调CCl4诱导的大鼠肝脏Smad7表达，提示AA可能通过上调Smad7水平，阻断TGF-β信号转导通路而抑制肝纤维化进程，且具有量效关系，随着剂量增大，其效果愈显著。小结
　　 积雪草酸可减轻CCl4诱导的大鼠肝脏炎症损伤，对肝脏具有保护作用；积雪草酸能改善肝脏组织形态，减少肝脏中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原沉积，减轻肝纤维化，并呈剂量依赖关系。积雪草酸阻断肝纤维化机制可能与其减少肝星状细胞活化，并通过上调Smad7表达调节TGF-β/Smad有关。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分 积雪草酸对CCl4诱导的大鼠血清酶指标的影响

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分 积雪草酸对CCl4诱导的大鼠肝脏组织病理和胶原成分的影响

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

第三部分 积雪草酸对CCl4诱导的大鼠肝脏中α-SMA表达的影响

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

第四部分 积雪草酸对CCl4诱导的大鼠肝脏中Smad7表达的影响

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

全文总结

参考文献

附录

致谢