靶向性基因治疗在肝癌及器官移植中的应用研究

摘要

研究背景：
　　 靶向性基因治疗作为一种新的治疗手段受到越来越多的关注。选择适当的靶向机制可以提高载体体内转染率，保证目的基因表达和对目的细胞杀伤的同时，减少对机体正常细胞的影响。
　　 有效的载体系统是靶向性基因治疗成功的关键因素之一。在普遍使用的载体系统中，非病毒载体(non-viral vector)的安全性较病毒载体(viral vector)有了很大的提高。靶向性纳米聚合物作为基因传输及疾病诊断试剂的载体受到了日益密切的关注。生物医用高分子材料由于其在作为非病毒载体的同时可以具备靶向载体及造影剂等功能而备受关注。聚乙烯亚胺(PEI)是一种经典而有效的阳离子聚合物非病毒载体。基于超顺磁性氧化铁(super paramagnetic ironox ide，SPIO)的纳米颗粒是主要的MRI分子探针，已在探测肿瘤分子和细胞水平的变化中显示出不可替代的优越性。
　　 原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，由于其高死亡率而严重危害患者的健康。原发性肝癌首选的治疗方法是手术切除，但由于起病隐匿，多数的肝癌患者就诊时已达中晚期，且多伴有肝内转移和/或门脉癌栓，手术切除的机会很少。目前的一些治疗方法如射频消融、微波、无水乙醇瘤内注射、放疗、生物治疗等效果有限。因此临床医生和科研工作者正在努力寻找包括靶向治疗等更好的治疗方法，并从肝癌发生发展的基因调控机制中寻找新的药物靶点，以求提高对肝癌的诊治能力。本研究设计了叶酸受体靶向的纳米载体，对其在肝细胞癌基因治疗和诊断的作用进行了有意义的探讨。
　　 肝移植术也是一种针对原发性肝癌彻底而有效的治疗手段，但术后发生的急慢性排斥反应是临床器官移植中难以克服的问题。长期使用免疫抑制剂会带来许多严重副作用。本研究利用靶向性载体，通过转基因技术，在活体实验中抑制急性排斥反应，为临床诱导免疫耐受的新方法提供理论依据和实践基础。
　　 目的：
　　 本文设计和研究了几种可以用于传输基因及肿瘤诊断试剂的聚合物，并从肿瘤及器官移植急性排斥反应的诊断及治疗角度对其作用进行探讨。
　　 方法：
　　 1.构建真核表达质粒pEGFP-N3-p53，并鉴定该重组质粒构建正确；
　　 构建靶向性Fa-PEG-PEI-SPIO共聚物对该质粒进行复合，并利用凝胶电泳阻滞实验，粒径与电位的测量，观察Fa-PEG-PEI-SPIO/pEGFP-N3-p53的复合效果；
　　 检测纳米复合物对SMMC-7721细胞的毒性、转染效果及p53蛋白表达的影响；
　　 建立裸鼠SMMC-7721移植瘤，对Fa-PEG-PEI-SPIO/pEGFP-N3-p53及PEG-PEI-SPIO/pEGFP-N3-p53共聚物的治疗及MRI显像效果进行观察与比较。
　　 2.构建真核表达质粒pcdna3.1-DGK-C-3xflag，并鉴定该重组质粒构建正确；
　　 将T细胞特异性配体CD3单链抗体(scAbCD3)连接到载体PEG-PEI-SPIO的PEG端(scAbCD3-PEG-PEI-SPIO)，构建靶向性scAbCD3-PEG-PEI-SPIO共聚物并复合该质粒。观察scAbCD3-PEG-PEI-SPIO/pcdna3.1-DGK-C-3xflag的复合效果；
　　 建立大鼠同种异体异位心脏移植急性排斥模型(BN-to-Lew)，对靶向性纳米复合物scAbCD3-PEG-PEI-SPI0/pcdna3.1-DGK-C-3xflag与非靶向性纳米复合物PEG-PEI-SPIO/pcdna3.1-DGK-C-3xflag的治疗效果和显像作用进行比较。
　　 结果：
　　 1.成功建立真核表达质粒pEGFP-N3-p53，并对其进行验证；
　　 构建靶向性Fa-PEG-PEI-SPIO共聚物，并确定其与pEGFP-N3-p53质粒复合时的最佳N/P为10时复合效果最好，而且在SMMC-7721细胞中有良好的转染效果，p53蛋白的表达情况也较非靶向性材料PEG-PEI-SPIO为好；
　　 在裸鼠移植瘤中，Fa-PEG-PEI-SPIO/pEGFP-N3-p53表现出良好的MRI显像效果及肿瘤生长抑制效果。
　　 2.成功构建真核表达质粒pcdna3.1-DGK-C-3xflag；
　　 构建T细胞靶向性载体scAbCD3-PEG-PEI-SPIO，并于N/P为10时复合质粒取得良好效果；
　　 在大鼠同种异体异位心脏移植急性排斥模型中，scAbCD3-PEG-PEI-SPIO的MRI显像效果明显好于非靶向材料PEG-PEI-SPIO，而且治疗效果明显。
　　 结论：
　　 1.本文证明靶向性纳米复合物载体的pDNA复合物的细胞毒性低，转染效率高，为优化以非病毒载体阳离子多聚物为骨架的靶向性基因传递系统提供了新的方法；
　　 2.靶向性纳米复合物载体负载SPIO后，作为具有靶向功能的MRI分子探针具有很强的可行性和很高的实用价值。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

引言

第一章Fa-PEG-PEI-SPIO／pEGFP-N3-p53靶向性纳米复合物的合成及其在肝细胞癌诊断治疗中应用的体内、外实验研究

第一节人pEGFP-N3-p53蛋白真核表达质粒的构建

1.1材料与方法

1.2结果与讨论

第二节 叶酸功能化的聚乙二醇-聚乙烯亚胺负载超顺磁四氧化三铁纳米粒子合成及其性质

2.1仪器及试剂

2.2实验方法

2.3结果与讨论

第三节Fa-PEG-PEI-SPIO复合pEGFP-N3-p53质粒在7721细胞的体外实验研究

3.1材料与方法

3.2实验结果与讨论

第四节Fa-PEG-PEI-SPIO复合pEGFP-N3-p53质粒对肝外移植瘤的诊断与治疗作用的体内实验研究

4.1材料与方法

4.2结果

讨论

小结

第二章scAbCD3-PEG-PEI-SPIO／pcDNA3.1-DGK-C-3xflag靶向性纳米复合物的合成及其在移植心脏移植急性排斥反应中应用的体内实验研究

第一节大鼠DGK蛋白真核表达质粒的构建

1.1材料与方法

1.2结果

第二节CD3功能化的聚乙二醇-聚乙烯亚胺负载超顺磁四氧化三铁纳米粒子合成

2.1仪器及试剂

2.2实验方法

2.3结果与讨论

第三节scAbCD3-PEG-PEI-SPIO／pcDNA3.1-DGK-C-3xflag靶向性纳米复合物的合成及其体内抑制急性排斥反应

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论

小结

结论

参考文献

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