诱导小鼠胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞及糖尿病模型体内移植研究

摘要

本课题拟在体外模拟胰腺发育程序，采用表观遗传修饰联合多种诱导因子的方法诱导ES细胞逐步向内胚层—胰腺前体细胞—胰岛素分泌细胞分化，旨在进一步提高ES源性胰岛素分泌细胞的获得效率，为体内移植研究提供充足、高质量的细胞来源。在体外研究的基础上，为探索建立一种高效、无创、安全的移植细胞示踪方法，我们以超顺磁氧化铁颗粒标记ES源性胰岛素分泌细胞，并移植入糖尿病动物模型体内，通过核磁共振(MRI)活体示踪技术动态、连续、无创性的观察移植细胞在糖尿病动物模型体内定居、迁移、增殖及功能发挥情况。本课题有望为ES源性胰岛素分泌细胞移植治疗糖尿病研究进一步奠定实验基础和提供实验依据。
　　 第一部分表观遗传修饰诱导小鼠ES细胞分化为胰岛素分泌细胞
　　 目的：探讨体外模拟胰腺发育过程，程序性高效诱导ES细胞分化为胰岛素分泌细胞的可行性，从而为体内移植研究提供充足、高质量的细胞来源；同时从microRNA角度初步探讨ES细胞分化为胰岛素分泌细胞的分子机制。
　　 方法：首先通过碱性磷酸酶试验和体内分化试验鉴定E14小鼠ES细胞的分化全能性；然后常规培养ES细胞，并悬浮培养4d以形成拟胚体(embryonic bodies，EBs)，转移EBs到铺有明胶的6孔板中并添加不同浓度的丁酸钠(1mmol/L，2mmol/L，3mmol/L)开始诱导EBs向胰腺前体细胞方向分化，分化过程中通过RT-PCR检测胰腺前体细胞特异性标志基因巢蛋白(nestin)、胰腺十二指肠同源异形盒(pancreatic/duodenal homeobox-1，PDX-1)和神经元素3(Neurogenin3，NgN3)的mRNA表达水平，以及肝脏前体细胞特异性基因细胞角蛋白19(cytokeratin19，CK19)，甲胎蛋白(α-fetal protein，AFP)，甲状腺素运载蛋白(transthyretin，TTR)、α1抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin，AAT)的mRNA表达水平，确定丁酸钠诱导EBs向胰腺前体细胞方向分化的最佳作用浓度和作用时间；然后于培养体系中顺序添加25ng/mL activin A，10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，10ng/mL肝细胞生长因子(hepatocytegrowth factor，HGF)以及10mmol/L尼克酰胺(nicotinamide)，促进胰腺前体细胞进一步分化成熟为胰岛素分泌细胞。采用Real-time PCR和免疫荧光技术检测成熟的胰岛素分泌细胞特异性标志蛋白PDX-1、胰岛素(insulin)、C肽(C-peptide)的表达，通过葡萄糖刺激的胰岛素分泌试验检测分化细胞分泌胰岛素的功能情况；流式细胞技术检测分化细胞的分化效率；并采用microRNA芯片技术和real-time PCR检测ES细胞向胰岛素分泌细胞分化过程中microRNA的差异表达情况。
　　 结果：E14 ES细胞具有分化为内、中、外三个胚层来源组织细胞的能力；探索丁酸钠最佳诱导浓度的实验结果显示，1 mmol/L丁酸钠能明显促进胰腺前体细胞特异性标志基因nestin、PDX-1和NgN3的表达，随着丁酸钠浓度的增加，向胰腺前体细胞方向的诱导作用逐渐减弱；在1mmol/L丁酸钠的诱导作用下，与胰腺前体细胞同属内胚层来源的肝脏前体细胞特异性标志基因CK19、AFP、AAT和TTR开始表达，随着丁酸钠浓度的增加，上述基因表达水平逐渐增强，以3mmol/L丁酸钠诱导肝脏前体细胞基因表达的作用最强。关于丁酸钠最佳作用时间的实验结果显示，1mmol/L丁酸钠诱导第3d后可检测到胰腺前体细胞标志基因PDX-1、NgN3和p48的表达，随后表达水平逐渐下降；3mmol/L丁酸钠诱导第3d后，可检测到肝脏前体细胞特异性基因CK19、AFP、AAT和TTR的表达，且表达水平随时间变化逐渐增强。在应用activin A、丁酸钠诱导EBs向胰腺前体细胞分化后，序贯以bFGF、尼克酰胺和HGF诱导胰腺前体细胞进一步分化成熟，RT-PCR检测显示诱导过程中成熟的胰腺特异性标志基因insulin、C-peptide的表达逐渐增强，免疫荧光结果显示胰腺特异性标志蛋白insulin和C-peptide表达为阳性。葡萄糖刺激的胰岛素释放实验显示，在3mmol/L葡萄糖刺激下，30分钟内分化细胞释放的胰岛素水平是229±32.5pg/mg蛋白，在22mmol/L葡萄糖刺激下，30分钟内分化细胞释放的胰岛素水平是1373±116pg/mg蛋白，高糖刺激下胰岛素的释放水平约为低糖刺激时胰岛素水平的6倍。流式细胞技术检测结果显示，分化终末期C-peptide阳性的细胞数约占分化细胞总数的21％。microRNA芯片及Real-time PCR检测显示ES细胞分化为胰岛素分泌细胞过程中，一种胰腺特异性microRNA-miR-375的水平呈阶段性差异表达。
　　 结论：低浓度的组蛋白去乙酰化酶抑止剂丁酸钠短时间作用可以较高效率的诱导小鼠ES细胞分化为胰腺前体细胞，与其它胰腺分化相关诱导因子联合作用，能进一步提高成熟胰岛素分泌细胞的获得效率；胰腺特异性microRNAmiR-375可能在ES细胞向胰岛素分泌细胞分化过程中起着重要的调控作用。
　　 第二部分ES源性胰岛素分泌细胞糖尿病模型体内移植实验研究
　　 目的：探讨以核磁共振(MRI)活体示踪技术动态、连续、无创性的观察ES源性胰岛素分泌细胞在糖尿病动物模型体内定居、迁移、增殖及功能发挥情况的可行性。
　　 方法：分别以10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL浓度的超顺磁性氧化铁颗粒(菲立磁-硫酸鱼精蛋白复合体)标记待移植ES源性胰岛素分泌细胞，通过流式细胞技术及透射电镜观察菲立磁对细胞增殖的影响，以普鲁士蓝染色试验计算菲立磁标记效率，并体外检测数量级为1×104、5×104、1×105、5×105、1×106的标记细胞在MRI下引发磁信号改变情况。以STZ腹腔注射制备小鼠糖尿病模型，监测血糖水平的变化。成模后将菲立磁标记的ES源性胰岛素分泌细胞移植到糖尿病模型的左肾包膜下，定期行MRI扫描观察移植细胞在受体体内的定居、增殖和迁移情况；根据MRI结果切取出现低信号改变区域的组织，行普鲁士蓝染色观察移植细胞在组织局部的分布情况，并通过免疫荧光检测insulin的表达进行验证；同时检测糖尿病动物模型的血糖水平及存活率，评估移植细胞在体内功能发挥情况。
　　 结果：10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL浓度的菲立磁标记对ES源性胰岛素分泌细胞形态无明显影响，凋亡率和细胞增殖活性与未标记细胞相比无显著差别。菲立磁-硫酸鱼精蛋白复合体孵育ES细胞4h后，经普鲁士蓝染色可见细胞质内出现蓝染颗粒，10μg/mL、25μg/mL菲立磁标记组标记率较50μg/mL、100μg/mL标记组为低(p＜0.05)，50μg/mL和100μg/mL标记组的标记效率比较无统计学差异(p＞0.05)，在50μg/mL时标记效率已达98％以上。体外MRI检测结果显示，50μg/mL菲立磁标记的5×104个ES源性胰岛素分泌细胞即可引起T1WI和T2WI序列低信号改变，尤其以T2WI序列改变更为明显。标记细胞移植到小鼠糖尿病模型左肾包膜下之后定期(1w,2w,3w,4w)行腹部MRI扫描，由于移植细胞内的氧化铁颗粒可引起肾脏异常低信号改变，移植后即可检测到移植细胞定居于左肾包膜下，随着时间推移可以观察到部分移植细胞由左肾包膜下逐渐向腹膜后、右肾迁移，移植第3周MRI检测到脾脏内弥漫性低信号改变，提示部分移植细胞迁移至脾脏。普鲁士蓝染色可见肾包膜及脾实质内均出现蓝染的颗粒，免疫荧光检测结果显示在肾包膜下及脾实质内可见insulin阳性的胰岛素分泌细胞存在。糖尿病动物模型造模成功后，血糖水平均超过13.9 mmol/L。与对照组相比，移植ES源性胰岛素分泌细胞组的血糖水平在移植1w后逐渐下降，至移植约第2周时，血糖水平降至10.86±2.09 mmol/L。在实验第4周，移植分化细胞组动物模型的存活率约为62.5％，对照组存活率为37.5％。
　　 结论：超顺磁性氧化铁颗粒菲立磁可高效、安全地对ES源性胰岛素分泌细胞进行磁性标记；MRI活体示踪的方法可实现动态、连续、无创性的观察ES源性胰岛素分泌细胞在受体体内定居、迁移、增殖情况；分化的胰岛素分泌细胞移植入糖尿病模型后，可在一定程度上改善模型的高血糖状态。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词中英文对照

第一部分表观遗传修饰诱导小鼠胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

附图

第二部分 ES源性胰岛素分泌细胞糖尿病模型体内移植后活体示踪研究

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

附图

本课题创新之处、本课题不足之处

附件

致谢