构建CRISPR/Cas9慢病毒载体敲除人肝癌细胞株MyD88基因

摘要

目的：
　　1、通过构建CRISPR/Cas9慢病毒载体，感染SMMC-7721细胞，获得稳定表达 Cas9蛋白的 SMMC-7721-Cas9细胞以及 MyD88基因敲除的SMMC-7721-MyD88-/-/MyD88+/+混合细胞，搭建CRISPR/Cas9基因编辑平台。
　　2、SMMC-7721-MyD88-/-单克隆细胞的筛选与敲除鉴定。
　　方法：
　　1、CRISPR/Cas9基因编辑平台的搭建：
　　（1）设计合成MyD88基因特异性的3对sgRNA（sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-3），并将其连接到表达质粒 GV375上，重组的 GV375表达质粒与包装质粒共转染到293T细胞内，产生慢病毒颗粒，并通过荧光法检测病毒滴度；
　　（2）确定慢病毒感染的最适MOI，以及嘌呤霉素筛选的最适剂量；
　　（3）首先将Lenti-Cas9-puro慢病毒感染SMMC-7721细胞，经嘌呤霉素筛选得到 SMMC-7721-Cas9细胞，然后用 Lenti-sgRNA-Cherry病毒感染SMMC-7721-Cas9细胞，获得SMMC-7721-MyD88-/-/MyD88+/+混合细胞，并通过PCR、测序和Western blot等方法在基因和蛋白水平上进行Pool克隆细胞敲除验证；
　　2、SMMC-7721-MyD88-/-单克隆细胞的筛选与敲除鉴定
　　有限稀释法挑取单克隆，运用PCR、测序、TA克隆以及Western blot等方法在基因和蛋白水平上进行单克隆细胞敲除鉴定；
　　结果：
　　1、CRISPR/Cas9基因编辑平台的搭建：
　　（1）测序验证GV375慢病毒重组表达载体构建成功；
　　（2）重组表达载体和包装载体共转染到293T细胞后，产生的慢病毒颗粒滴度为1×108TU/ml以上；
　　（3）流式细胞术检测MOI为100、10、1时，慢病毒感染效率分别92.27%、88.58%和60.03%，确定最适 MOI为10；并确定了嘌呤霉素最佳筛选剂量为3μg/ml；
　　（4）成功构建了稳定表达Cas9蛋白的SMMC-7721-Cas9细胞和MyD88基因敲除的 SMMC-7721-MyD88-/-/MyD88+/+混合细胞模型，SMMC-7721-MyD88-/-/MyD88+/+混合细胞测序结果出现套峰，并且 MyD88蛋白表达水平较正常细胞和空载对照组显著降低；
　　2、SMMC-7721-MyD88-/-单克隆细胞的筛选与敲除鉴定：
　　成功挑取SMMC-7721-MyD88-/-单克隆细胞，测序验证显示在敲除靶点处插入一个碱基A，TA克隆结果显示为等位基因两条链敲除相同碱基的纯合克隆；在蛋白水平上，Western blot结果显示MyD88基因敲除的SMMC-7721-MyD88-/-细胞中MyD88基因完全不表达，而正常细胞组和空载对照组都有表达。
　　结论：
　　1、成功构建了CRISPR/Cas9慢病毒载体并感染SMMC-7721细胞，获得稳定表达 Cas9蛋白的 SMMC-7721-Cas9细胞和 MyD88基因敲除的SMMC-7721-MyD88-/-/MyD88+/+混合细胞，为敲除SMMC-7721中其他基因提供实验基础；
　　2、成功挑取单克隆细胞，获得 MyD88等位基因纯合敲除的SMMC-7721-MyD88-/-细胞，为研究 MyD88基因对肝癌细胞作用机制提供了实验基础。

目录

声明

中英文缩略词表

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验仪器

2.2 实验试剂

2.3 试剂的配制

2.4 实验方法

3 结果

3.1 sgRNA表达载体构建

3.2 病毒滴度的测定

3.3 慢病毒感染

3.4 敲除验证

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢

综述:Toll样受体信号转导与原发性肝癌发生发展关系的研究进展