利用CRISPR/Cas9系统构建人源结肠癌SAMHD1基因敲除细胞株及其功能的初步研究

摘要

目的通过常间回文重复序列丛集(CRISPR)/常间回文重复序列丛集关联蛋白9(Cas9)系统敲除技术靶向敲除人源结肠癌HCT116细胞中的SAMHD1基因,并初步研究敲除该基因后HCT116细胞增殖能力的变化。方法利用单向导RNA(sgRNA)在线设计工具,针对SAMHD1设计sgRNA;利用pYSY-CMV-Cas9-EF1α-Puromycin质粒载体,构建pYSY-CMV-Cas9-EF1α-PuromycinsgRNA-SAMHD1;转染HCT116细胞株,以嘌呤霉素进行筛选鉴定后,采用蛋白质印迹法检测HCT116细胞中SAMHD1蛋白表达水平;采用蛋白质印迹法检测靶向敲除SAMHD1基因后HCT116细胞株DNA损伤修复能力的变化;通过光学显微镜和CCK-8法比较Cas9-vector组(HCT116细胞中转染pYSY-CMV-Cas9-EF1α-Puromycin载体质粒,对照组)和Cas9-SAMHD1组(转染pYSY-CMVCas9-EF1α-Puromycin-sgRNA-SAMHD1靶向敲除SAMHD1质粒,实验组)的细胞数量和增殖能力水平。结果通过酶切载体、退火产物结果和重组质粒的测序结果,验证重组质粒构建成功;蛋白质印迹法检测结果验证明利用CRISPR/Cas9系统技术靶向敲除SAMHD1的HCT116细胞株无SAMHD1蛋白表达,即Cas9-SAMHD1细胞株构建成功;蛋白质印迹法结果显示,Cas9-SAMHD1组与Cas9-vector组相比,在DNA损伤诱导剂阿霉素刺激作用下DNA损伤指标γH2AX降低;光学显微镜和CCK-8结果显示,Cas9-SAMHD1组与Cas9-vector组相比,细胞增殖能力显著增强(P<0.01)。结论采用CRISPR/Cas9系统成功敲除人源结肠癌细胞SAMHD1基因后,结肠癌细胞的增殖能力和DNA损伤修复能力显著增强。