胆固醇氧化酶的分离纯化及酶学性质的研究

摘要

为了应用胆固醇氧化酶来降解和转化食品中的胆固醇，以本实验室筛选的青霉TS406菌株为对象，从诱变育种、胆固醇氧化酶的提纯、胆固醇氧化酶的酶学性质、胆固醇氧化酶降解蛋黄胆固醇等方面进行了研究。 青霉TS406是一株产生胞外胆固醇氧化酶的菌株，在理化因子单因素诱变的基础上，通过紫外线联合硫酸二乙酯(浓度3％)和紫外线联合亚硝基胍(1.2mg/ml)两次连续复合诱变，获得了一株高产型突变株，其产酶活力从546U/L提高到了1267U/L，酶活提高了273％，并利用SPSS软件分析证明了突变菌株的产酶稳定性。 通过硫酸铵盐析，Sephadex G-75凝胶层析，DEAE-Sephadex A50离子交换层析等方法分离提纯了菌株TS406产生的胆固醇氧化酶(COD)，其比活力为16.068u/mg，采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得该胆固醇氧化酶的分子量为30KD，并且证明了该胆固醇氧化酶为单一的肽段。 在不同条件下测定胆固醇氧化酶的活性，得到胆固醇氧化酶的最适反应温度为45℃，最适pH值为7.5，在≤40℃的条件下能够稳定保藏，在不同的反应时间对胆固醇的氧化降解反应呈现不同的规律，反应的Km值为5.0×10-4。 将胆固醇氧化酶与蛋黄反应，发现作用24小时后蛋黄胆固醇的降解率达到33.8％。

目录

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声明

第一章 前言

1文献综述

1.1胆固醇及其生理功能

1.2胆固醇氧化酶的来源

1.3胆固醇氧化酶的基本性质

1.4胆固醇氧化酶的分离纯化研究

1.5分离纯化中存在的问题及发展方向

1.6胆固醇氧化酶的应用

2选题意义

第二章 胆固醇氧化酶产生菌TS406的复合诱变育种

1材料与方法

1.1培养基

1.2试剂与仪器

1.3实验方法

2结果与分析

2.1诱变方法的确定

2.2高产菌株的筛选

2.3稳定性检验

2.4突变菌株的生理生化鉴定

3结论

第三章 胆固醇氧化酶的分离纯化

1材料及方法

1.1材料

1.2酶活力的测定

1.3蛋白质浓度的测定

1.4缓冲液的配制

1.5粗酶液的制备

1.6硫酸铵沉淀

1.7葡聚糖G75凝胶层析

1.8 DEAE-Sephadex A-50层析

1.9不连续SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

2结果分析

2.1最佳盐析浓度的确定

2.2葡聚糖G75凝胶层析洗脱曲线

2.3 DEAE-Sephadex A-50洗脱曲线

2.4不同步骤的分离纯化效果计算

2.5 SDS-PAGE测分子量

3结论

第四章 胆固醇氧化酶的性质

1材料及方法

1.1材料

1.2实验方法

2结果分析

2.1最适pH值

2.2最适温度

2.3热稳定性曲线

2.4反应进程曲线

2.5 Lineweaver-Burk双倒数曲线

3结论

第五章 胆固醇氧化酶在蛋黄中的应用研究

1实验方法

1.1蛋黄中总胆固醇含量的测定

1.2胆固醇氧化酶对蛋黄的降解实验

2结果与分析

2.1蛋黄胆固醇的降解效率

2.2蛋黄胆固醇降解后的表观特征

3结论

第六章 结论

参考文献

致谢