南极衣藻谷胱甘肽还原酶基因的克隆、表达与定量分析

摘要

谷胱甘肽还原酶(GR)是生物体内重要的抗氧化酶。本研究对南极衣藻GR的全长cDNA进行克隆,并构建了该基因的原核表达载体。同时,分析了GR基因在不同盐度和CdCl2作用前后的表达变化。此外,还克隆了南极冰藻β-肌动蛋白基因(ICE-Lactin GenBank accession number:HM114222)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ICE-LGAPDH GenBank accession number:HM114223)的部分cDNA序列。
　　 以提取的南极衣藻Chlamydomonas sp.ICE-L总RNA为模板,根据报道的多种藻类及植物的谷胱甘肽还原酶保守区设计简并引物,应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了ICE-L GR基因(GenBank accession number:GU395492),并对其进行了全面的生物信息学分析。ICE-L GR全长1913bp,包含90bp的5'非编码区(UTR)和365bp的3'UTR:开放阅读框(ORF)长1458bp,编码485个氨基酸,终止密码子为UGA,分子量计算值(MW)为52.155kDa,理论等电点(PI)为5.56；ICE-L GR氨基酸序列与莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、绿色鞭毛藻(Ostreococcuslucimarinus)、海链藻(Thalassiosira pseudonana)、石莼(Ulva fasciata)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、芥菜(Brassica juncea)、大豆(Gtycine max)、及水稻(Oryza sativa)的GR氨基酸序列同源性较高。
　　 在克隆GR全长的基础上,构建了其原核表达载体pET-GR,并将其导入大肠杆菌BL21进行融合蛋白的表达,SDS-PAGE电泳结果显示,获得目的蛋白符合预计分子量。通过对诱导时间、IPTG浓度、温度的优化,最终确定GR蛋白在大肠杆菌中诱导表达优化条件为:IPTG浓度为1.0mmol/L,28℃诱导3h;且表达的蛋白均以包涵体的形式存在。
　　 应用实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR),以ICE-Lβ-actin和ICE-L GAPDH基因为内参照,研究了ICE-L GR基因在低盐度、高盐度和不同浓度CdCl2(μmol/L)作用前后的表达变化。在偏离最适生长盐度下,盐度11、22、66在第24h表达量最大,盐度99在12h达到最大表达量；重金属CdCl2作用后,低CdCl2浓度诱导表达上调,20、40μmol/L在第12h最大量表达,60、80μmol/L在第18h表达量最大。
　　 本论文的研究结果为探讨南极冰藻谷胱甘肽及其相关酶基因的作用机理和调控机制奠定了坚实的基础；丰富生物谷胱甘肽还原酶基因的普遍性和多样性；对于全面了解和认识南极生物谷胱甘肽相关酶基因的结构、功能、特性,有效地阐明南极微生物对各种胁迫的适应性都具有重要的理论指导意义,而且能为抗逆领域特别是抗逆基因工程提供新的思路和新的基因。

目录

文摘

英文文摘

缩略词

1文献综述

1．1南极微藻

1．1．1南极微藻的研究背景

1．1．2南极微藻的生长环境

1．1．3南极微藻的生态学意义

1．1．4南极微藻的应用前景

1．1．5展望

1．2谷胱甘肽的性质及生理功能

1．2．1谷胱甘肽和抗氧化

1．2．2谷胱甘肽和信号转导

1．3谷胱甘肽还原酶

1．3．1谷胱甘肽还原酶的生物学意义

1．3．2 GR的分布及其原因

1．3．3植物中GR的功能研究

1．4研究目的及意义

2谷胱甘肽还原酶全长基因的克隆

2．1实验材料

2．1．1藻种来源

2．1．2质粒载体和受体菌

2．1．3工具酶及试剂盒

2．1．4主要溶液和试剂的配制

2．1．5主要仪器

2．2实验方法

2．2．1藻的培养

2．2．2总RNA的提取

2．2．3 ICE-L GR基因的RACE克隆

2．3结果与分析

2．3．1总RNA的质量鉴定

2．3．2 cDNA-链的合成

2．3．3 ICE-L GR基因全长cDNA序列的克隆

2．3．4 GR基因序列特征分析

2．3．5 ICE-L GR基因的生物信息学分析

2．4讨论

2．4．1 Chlamydomonas sp．ICE-L RNA提取成功的关键

2．4．2简并引物的合理设计及选择

3谷胱甘肽还原酶基因的原核表达

3．1实验材料

3．1．1藻种与培养基

3．1．2质粒与受体菌

3．1．3主要工具酶及试剂盒

3．1．4主要试剂

3．1．5主要仪器

3．2实验方法

3．2．1重组质粒pET-GR构建

3．2．2重组表达质粒的提取

3．2．3重组表达质粒的双酶切鉴定

3．2．4基因工程重组表达菌株的诱导表达

3．3实验结果

3．3．1 ICE-L GR基因ORF的扩增

3．3．2质粒提取结果

3．3．3 pET-21a空质粒双酶切和PCR产物双酶切

3．3．4菌落PCR筛选阳性克隆与重组质粒酶切结果

3．3．5表达产物的鉴定

3．3．6 GR蛋白在大肠杆菌中表达条件的摸索

3．4讨论

4衣藻ICE-L在不同条件下的差异表达研究

4．1试剂及仪器

4．2实验方法

4．2．1引物设计

4．2．2实验设计

4．2．3总RNA的DNase Ⅰ消化

4．2．4扩增效率的确定

4．2．5 GR的荧光定量PCR

4．2．6数据统计与分析

4．3结果与分析

4．3．1 Chlamydomonas sp．ICE-L GR基因在不同盐度下的表达分析

4．3．2 Chlamydomonas sp．ICE-L GR基因在不同CdCl2浓度下的表达分析

4．4讨论

5结论

5．1南极衣藻Chlamydomonas sp．ICE-L GR基因克隆

5．2南极衣藻Chlamydomonas sp．ICE-L GR原核表达

5．3南极衣藻Chlamydomonas sp．ICE-L GR Real-time PCR表达分析

参考文献

致谢

附录

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