声明
前言
1、 材料与方法
1.实验材料
1.1 H9C2大鼠胚胎心肌细胞株，上海吉凯公司
1.2主要试剂
1.3 主要仪器与耗材
2、实验方法
2.1 H9C2心肌细胞培养方法
2.2 细胞复苏
2.3细胞冻存
2.4 高糖诱导心肌细胞损伤的干预
2.5 心肌细胞计数方法
2.6 ALDH2基因过表达稳定细胞株的构建与鉴定
2.6.1 预实验：最适MOI的摸索
2.6.2 H9C2细胞嘌呤霉素浓度的确定
2.6.3 ALDH2基因过表达慢病毒载体转染H9C2心肌细胞
2.6.4 Western blot检测ALDH2基因过表达稳定感染细胞株中ALDH2蛋白水平的表达
2.6.5 RT-PCR法检测ALDH2基因过表达稳定转染细胞株中ALDH2 mRNA水平的表达
2.7 实验分组
2.8 CCK8检测不同处理组细胞活力
2.9 Mitosox 染色观察线粒体氧化应激情况
2.10 酶联免疫吸附法检测各组细胞上清液中4-HNE、IL-18及IL-1β水平
2.11各组细胞中ALDH2活性测定
2.12 Western blot检测各处理组中ALDH2、NLRP3、ASC、Caspase-1的蛋白表达
2.13 数据的统计学分析
实验结果
3.1 Western blot检测高糖干预24h、36h、48h后炎症小体相关蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1的蛋白表达结果
3.2 ALDH2基因过表达稳定细胞株构建成功
3.3 Western blot检测ALDH2基因过表达稳定细胞株中ALDH2蛋白水平的结果
3.4 Real time PCR法检测ALDH2基因过表达稳定细胞株中ALDH2 mRNA水平的表达
3.5 CCK8法检测各组细胞活力结果
3.6 Mitosox染色观察线粒体氧化应激情况
3.7 各组细胞上清液中4-HNE、IL-18及IL-1β水平情况
3.8 各组细胞中ALDH2活性水平、蛋白水平表达情况
3.9 各组细胞中NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白水平的表达情况
讨论
结论
参考文献
致谢
附录
附录B 主要试剂配制及操作方法
附录C 个人简历及论文发表情况
附录D 文献综述:细胞焦亡在心血管疾病中的作用
